RNAi基因沉默的動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展＊

孟 霞，魯秦安，唐彩琰，陳樹林＊，張文華

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西安文理學(xué)院，陜西西安 710065）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在進(jìn)化過(guò)程中，由高度保守的雙鏈RNA（double－stranded RNA，dsRNA）誘導(dǎo)同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象［1］。它是生物體抵御外來(lái)感染的一種重要保護(hù)機(jī)制，為此RNAi被《Science》雜志評(píng)為2001年十大科技突破之一，名列2002年十大科學(xué)之首。2002年Nature雜志亦將RNAi評(píng)為年度重大科技成果之一?，F(xiàn)已證明RNAi現(xiàn)象廣泛存在于大多數(shù)真核生物中。dsRNA作為細(xì)胞內(nèi)源性基因表達(dá)調(diào)節(jié)物，具有低毒性和高特異性等特點(diǎn)，且具有很強(qiáng)的基因沉默效率。dsRNA與靶基因有序列同源性，長(zhǎng)雙鏈RNA被導(dǎo)入或轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)時(shí)，會(huì)被Dicer酶（dsRNA specific endonuclease，Dicer）裂解成短小干擾 RNA（short－interfering RNA，siRNA），然后被結(jié)合到誘導(dǎo)沉默復(fù)合體RISC（RNA－induced silencing complex，RISC）上，引導(dǎo) Ago2蛋白（slicing protein Argonatue 2）裂解靶基因 mRNA［2］。RNA干擾以其序列特異性的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于阻斷或抑制基因表達(dá)，這也使得它成為基因功能和基因治療的研究工具。在RNAi發(fā)揮基因沉默效能的過(guò)程中，許多因素都會(huì)直接或間接的影響最終的沉默效率和沉默時(shí)間。這些因素可被分別定位于3個(gè)不同的層次，包括siRNA類型的選擇，siRNA的遞送過(guò)程及細(xì)胞內(nèi)的RNAi路徑。本文分別就這3個(gè)層次和RNAi基因沉默動(dòng)力學(xué)的數(shù)學(xué)模型及其應(yīng)用做一綜述，以期能幫助人們更深入地認(rèn)識(shí)RNAi，促進(jìn)RNAi在臨床上的應(yīng)用進(jìn)程。

1 干擾RNA類型的選擇

dsRNA是RNAi的初始誘導(dǎo)因子，但是，dsRNA必須被進(jìn)一步加工成適當(dāng)大小的siRNA才能發(fā)揮作用。RNAi的效應(yīng)分子主要有兩類，即siRNA和短發(fā)夾 RNA（short hairpin RNA，shRNA）。在被應(yīng)用于引發(fā)基因沉默效應(yīng)的過(guò)程中，化學(xué)合成的siRNA和載體表達(dá)的shRNA各存在其優(yōu)缺點(diǎn)，現(xiàn)從4個(gè)方面予以論述。

1.1 siRNA和shRNA在產(chǎn)生非特異性反應(yīng)方面的優(yōu)缺點(diǎn)

siRNA在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性較差，易被細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解，因此較易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)；shRNA在細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生，易于被細(xì)胞內(nèi)的特異機(jī)制進(jìn)行適當(dāng)?shù)募艚?，因此引起免疫副反?yīng)的幾率較小。細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的shRNA會(huì)與內(nèi)源性的微小RNA（microRNA，miRNA）競(jìng)爭(zhēng)核轉(zhuǎn)運(yùn)受體，干擾miRNA正常功能的發(fā)揮，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，而siRNA不會(huì)干擾miRNA的功能，不會(huì)產(chǎn)生類似的毒性。與shRNA相比，siRNA易于被進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，在不影響其沉默效率的同時(shí)提高其穩(wěn)定性，減輕非特異性反應(yīng)的發(fā)生。

1.2 siRNA和shRNA在沉默效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間方面的優(yōu)缺點(diǎn)

在分裂活躍的細(xì)胞中，固定數(shù)量的siRNA隨細(xì)胞的分裂不斷被稀釋，導(dǎo)致其沉默效應(yīng)的短暫性。載體表達(dá)的shRNA可被整合于宿主細(xì)胞染色體，由宿主細(xì)胞持續(xù)合成，使其沉默效應(yīng)能維持較長(zhǎng)時(shí)間。Rao D D等［3］研究表明，少于5個(gè)拷貝的shRNA整合入宿主染色體就能有效地引起長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默效應(yīng)。Takahashi Y等［4］研究表明，載體表達(dá)的shRNA誘導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間顯著長(zhǎng)于siRNA的沉默效應(yīng)時(shí)間。

1.3 siRNA和shRNA在轉(zhuǎn)染效率方面的優(yōu)缺點(diǎn)

siRNA在細(xì)胞質(zhì)中直接與RISC結(jié)合降解靶mRNA，因此，一旦siRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)便能立即發(fā)揮其基因沉默效應(yīng)。相反，shRNA的表達(dá)載體需要首先被轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄出shRNA，然后再將shRNA運(yùn)出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中被剪切成siRNA發(fā)揮作用?；蛑委熝芯勘砻?，跨細(xì)胞核運(yùn)輸是轉(zhuǎn)染過(guò)程中遇到的最大挑戰(zhàn)之一。因此，在轉(zhuǎn)染效率方面，siRNA較shRNA具有更大的優(yōu)勢(shì)。

1.4 siRNA和shRNA在臨床應(yīng)用方面的優(yōu)缺點(diǎn)

化學(xué)合成的siRNA引起短暫的基因沉默效應(yīng)，因此可根據(jù)治療需要隨時(shí)調(diào)整用量。shRNA表達(dá)載體通過(guò)插入基因組持續(xù)表達(dá)shRNA發(fā)揮作用，基因沉默效率相對(duì)較高。同時(shí)，插入shRNA表達(dá)載體的基因可因組蛋白的修飾和啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高度甲基化而被沉默，但這種染色質(zhì)的沉默不僅不能引起長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，還會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因活性逐漸消失。而且，細(xì)胞核內(nèi)shRNA連續(xù)的高濃度表達(dá)還會(huì)引起細(xì)胞毒性作用。

綜上考慮，siRNA和shRNA在發(fā)揮RNAi效應(yīng)的不同方面各存在優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)具體情況選擇合適的小干擾RNA。

2 siRNA的遞送

siRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因沉默，因此，化學(xué)合成的siRNA要想發(fā)揮沉默效應(yīng)，必須經(jīng)歷從體外到細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染過(guò)程，在其到達(dá)正確的靶細(xì)胞位置之前，有許多細(xì)胞外因素會(huì)影響它的穩(wěn)定性和傳遞效率，要想最終發(fā)揮良好的沉默效應(yīng)，必須克服這些障礙。siRNA的系統(tǒng)性遞送必須涉及提高其循環(huán)半衰期和組織靶向性的機(jī)制［5］。

2.1 機(jī)體中核糖核酸酶對(duì)siRNA的降解

眾所周知，siRNA極不穩(wěn)定，一旦進(jìn)入機(jī)體，會(huì)很快被細(xì)胞外環(huán)境中的核糖核酸酶（RNase）降解，導(dǎo)致其在血液中的半衰期不足30min。通過(guò)對(duì)siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾的方法可以增強(qiáng)其對(duì)血液中RNase的穩(wěn)定性［6］，保護(hù)其免受降解?；瘜W(xué)修飾主要包括糖配基修飾、磷酸鹽連接修飾、堿基修飾、末端懸掛堿基修飾和末端結(jié)構(gòu)修飾以及雙鏈結(jié)構(gòu)修飾等［7］。這些修飾不會(huì)減弱siRNA的作用，相反，在提高其穩(wěn)定性的同時(shí)，還可顯著提高其沉默效率。

2.2 腎對(duì)siRNA的清除

除了RNase導(dǎo)致的降解外，由于siRNA高度親水且其分子量很小，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于腎小球過(guò)濾的最小界限，它們可很快被腎小球?yàn)V過(guò)清除，因此，腎的清除是影響體內(nèi)siRNA半衰期的重要限制因素。有些化學(xué)修飾（如RNA骨架中的硫代磷酸酯連接和4＇含硫核苷酸）可通過(guò)促進(jìn)siRNA與血清蛋白的結(jié)合而提高它的半衰期。一種更方便快捷地調(diào)控和促進(jìn)siRNA生物分布的方法就是通過(guò)連接于小分子量配基來(lái)改變siRNA的結(jié)構(gòu)，幾個(gè)比較令人關(guān)注的例子就是siRNA與抗體重鏈Fab片段，與膽固醇、膽汁酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸等油脂分子，與細(xì)胞滲透性多肽（cell－penetrating peptides，CPP）等 的 結(jié) 合［8－9］。 抗體可精確識(shí)別細(xì)胞內(nèi)外抗原，實(shí)現(xiàn)siRNA的正確定位。siRNA有選擇地結(jié)合進(jìn)富含磷脂質(zhì)和膽固醇（主要是高密度脂蛋白和低密度脂蛋白）的脂蛋白顆粒內(nèi)。這些親脂性的siRNA－脂蛋白復(fù)合體通過(guò)回避腎的清除和經(jīng)由脂蛋白的受體促進(jìn)細(xì)胞的攝取而達(dá)到提高siRNA生物分布的作用。CPP又稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或膜轉(zhuǎn)導(dǎo)序列，它是短的陽(yáng)離子多肽，最多含有30個(gè)氨基酸，它可以通過(guò)直接穿越細(xì)胞膜或通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用被攝取而達(dá)到傳遞siRNA到細(xì)胞內(nèi)的作用。

2.3 siRNA的靶向性

siRNA準(zhǔn)確高效的干擾作用的發(fā)揮要求siRNA必須具有靶向性。研究證明，體細(xì)胞對(duì)siRNA會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，非靶向的細(xì)胞會(huì)攝取大量siRNA，在大量消耗siRNA的同時(shí)，還增強(qiáng)了炎癥反應(yīng)的程度。由此可見，siRNA的遞送方式也直接影響RNAi效應(yīng)的發(fā)揮。要解決這一問(wèn)題，就要找到適合特定組織的siRNA遞送方式。目前，已有很多成功的例子。

核苷酸還原酶M2亞基（RRM2）是一個(gè)抗癌靶點(diǎn)，Davis M E 等［10］使用納米顆粒包裹 RRM2 siRNA，并且在顆粒表面有轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）使其具有靶向性，將納米顆粒分別在第1、3、8、10、21天通過(guò)靜脈注射注入三位黑色素瘤患者體內(nèi)，并且不同患者給予不同的劑量。在經(jīng)過(guò)一個(gè)治療周期后，腫瘤組織活檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米顆?？梢蕴禺惗ㄎ挥谀[瘤組織當(dāng)中，而在其相鄰的表皮中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。腫瘤組織當(dāng)中的納米顆粒的密度隨著給藥劑量的增大而增強(qiáng)。此外，通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄－PCR（qRT－PCR）來(lái)測(cè)定患者腫瘤組織當(dāng)中的RRM2mRNA水平，經(jīng)過(guò)納米顆粒治療后，該mRNA水平有顯著降低，并且這一過(guò)程具有劑量依賴的關(guān)系。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及Western bot的方法證明在siRNA治療后，RRM2蛋白質(zhì)表達(dá)水平同樣降低。這些結(jié)果提示，全身給予攜帶siRNA的靶向納米顆粒后，該顆?？梢蕴禺愋缘囟ㄎ挥谀[瘤組織，并且有效地通過(guò)siRNA抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯從而達(dá)到治療效果。

脂質(zhì)納米顆粒（liposomal nanoparticles，LNPs）能有效地遞送siRNA，尤其是其中的一類稱為穩(wěn)定核酸脂質(zhì)復(fù)合物（stable nucleic acid lipid particle，SNALP），通過(guò)對(duì)脂類進(jìn)行PEG修飾使得復(fù)合物獲得了親水性外層，從而增強(qiáng)了其在血漿中的穩(wěn)定性。SNALP還增加siRNA的載荷并且改善細(xì)胞對(duì)siRNA的攝取及胞內(nèi)釋放，因此SNALP被應(yīng)用于人臨床治療中多種肝靶向性的RNAi項(xiàng)目。最近2年，研究發(fā)現(xiàn)了2種新型的可電離的和陽(yáng)離子的脂質(zhì)［11－12］，它們具有良好的活性，可被應(yīng)用于新一代的LNP－siRNA遞送系統(tǒng)。它們都介導(dǎo)有效的LNP對(duì)siRNA的遞送，分別被稱為可電離的LNPs（iLNPs）和陽(yáng)離子LNPs（cLNPs）。Akinc A 等［13］證明載脂蛋白E（apoE）是iLNPs的內(nèi)源性的靶向性配基，它介導(dǎo)iLNPs對(duì)siRNA的肝靶向性運(yùn)輸。

3 細(xì)胞內(nèi)的RNAi途徑

siRNA在克服RNase的降解和腎的清除作用順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，也有很多因素會(huì)影響其沉默效率。

3.1 siRNA從內(nèi)吞體的逃逸

被內(nèi)吞作用攝取的siRNA通常會(huì)被困在內(nèi)吞體中而無(wú)法擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，這種現(xiàn)象在主要通過(guò)內(nèi)吞作用被攝取的siRNA載體中最常見。這種情況下，如何提高siRNA從內(nèi)吞體的逃逸率成為關(guān)鍵問(wèn)題。截至目前，已有多種方法被用于應(yīng)對(duì)解決這一難題。在此以CPP的運(yùn)輸為例進(jìn)行說(shuō)明。CPP和siRNA的復(fù)合體主要通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入后即被困于內(nèi)吞體內(nèi)。主要有兩種方法可以促進(jìn)復(fù)合體的釋放。其一，可將能破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性的化學(xué)試劑或融合肽連接于siRNA／CPP復(fù)合體，通過(guò)破壞細(xì)胞膜促進(jìn)siRNA的釋放［14］。其二，可將光敏劑或熒光染料連接于siRNA／CPP復(fù)合體，在光刺激下，光敏劑或熒光染料誘導(dǎo)產(chǎn)生高活性的單線態(tài)氧，促進(jìn)內(nèi)吞體細(xì)胞膜破裂釋放siRNA。而且，這種光誘導(dǎo)的siRNA釋放方法還提供了一種從時(shí)空上控制RNAi的思路。Endoh T等［15］將一種僅在特定波長(zhǎng)下才被激活的熒光染料連接于CPP上，通過(guò)控制光強(qiáng)度調(diào)節(jié)RNAi的發(fā)生。在這種情況下，光刺激不是RNAi的增強(qiáng)因子，而是激發(fā)因子。這樣，就可人為地控制RNAi的發(fā)生時(shí)間，這對(duì)我們將RNAi應(yīng)用于局部治療是非常有利的。

3.2 細(xì)胞內(nèi)AGO蛋白的可用性

AGO蛋白是影響siRNA沉默效率的主要的細(xì)胞內(nèi)因子。Lund E等［16］研究表明，內(nèi)源性Ago2核酸內(nèi)切酶活性缺失的早期胚胎和卵母細(xì)胞不能發(fā)生RNAi。眾所周知，AGO蛋白是RISC中具有mRNA剪切活性和翻譯抑制活性的蛋白質(zhì)，siRNA先導(dǎo)鏈只有裝載于AGO蛋白上才能發(fā)揮基因沉默效應(yīng)［17］。而AGO蛋白還可結(jié)合miRNA，也就意味著如果AGO蛋白大部分被miRNA占據(jù)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的siRNA就會(huì)找不到AGO蛋白來(lái)對(duì)其進(jìn)行裝載，導(dǎo)致siRNA未發(fā)揮作用就被降解。就這一點(diǎn)而言，細(xì)胞內(nèi)RNAi的效率在很大程度上取決于AGO蛋白的可用性［18］。因此，如果要用外源性的siRNA來(lái)誘導(dǎo)RNAi，為取得良好的沉默效果，可以通過(guò)提高細(xì)胞表達(dá)AGO蛋白的效率來(lái)為外源siRNA提供充足的“空載”AGO蛋白。已經(jīng)有研究證明，AGO蛋白的超表達(dá)可以提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的RNAi效率［19］。但是，目前仍不知道機(jī)體內(nèi)AGO蛋白的表達(dá)是如何被調(diào)控的，也不知道如何控制AGO蛋白的表達(dá)，所以這方面還需進(jìn)一步的深入研究。

3.3 病毒編碼的RNAi沉默抑制因子

RNAi是機(jī)體內(nèi)部固有的抗病毒機(jī)制，為了克服這種抗病毒反應(yīng)，病毒也相應(yīng)的編碼一些RNAi沉默抑制因子（RNA silencing suppressor，RSS），這些RSS通過(guò)多種途徑降低RNAi的沉默效應(yīng)［20］。RSS主要以兩種形式發(fā)揮作用：蛋白質(zhì)形式和RNA形式。抑制蛋白可以通過(guò)抑制Dicer活性或者與dsRNA結(jié)合來(lái)降低RNAi的效率。病毒相關(guān)的RNA可以通過(guò)與Dicer和RISC結(jié)合使其達(dá)到飽和狀態(tài)不能結(jié)合siRNA而阻止RNAi反應(yīng)，它們還可以作為miRNA發(fā)揮作用抑制宿主mRNA的翻譯，同時(shí)，它們還通過(guò)抑制Exportin 5的作用限制premiRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸。為了提高RNAi效率，我們可以設(shè)計(jì)針對(duì)RSS的siRNA，通過(guò)限制RSS在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)減輕它的抑制效應(yīng)，從而使RNAi更好地發(fā)揮抗病毒作用。

3.4 預(yù)想的沉默目標(biāo)

細(xì)胞內(nèi)靶mRNA的數(shù)量和靶蛋白的穩(wěn)定性也會(huì)影響siRNA的干擾效率［21］。細(xì)胞內(nèi)siRNA的存活需要有效數(shù)量的靶mRNA的存在，因此靶mRNA的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)直接影響siRNA在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)時(shí)間。如果靶蛋白的半衰期很長(zhǎng)，即使siRNA能夠有效地抑制靶mRNA的翻譯，由于殘余數(shù)量的靶蛋白的存在，RNAi也不會(huì)改變細(xì)胞的表型。siRNA會(huì)隨細(xì)胞的分裂而被稀釋，細(xì)胞的分裂速率決定了RNAi的持續(xù)時(shí)間，因此靶細(xì)胞類型也會(huì)影響siRNA的干擾效率。

4 RNAi基因沉默動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型及其應(yīng)用

綜合以上分析，多種不同因素在不同層次上影響RNAi的效率，我們可以將各種關(guān)鍵的影響因素綜合起來(lái)，建立數(shù)學(xué)模型，系統(tǒng)深入的分析各種因素的作用，并以此作為參考，合理地設(shè)計(jì)siRNA治療方案，最終促進(jìn)RNAi在治療領(lǐng)域的應(yīng)用。

BartlettD W等［22］第一次構(gòu)建了包含諸如siRNA載體的生物分布和細(xì)胞內(nèi)siRNA的釋放等機(jī)體內(nèi)控制siRNA運(yùn)輸過(guò)程的各種因素的數(shù)學(xué)模型，用來(lái)進(jìn)行siRNA介導(dǎo)的基因沉默的動(dòng)力學(xué)研究。模型分析的結(jié)果也被用于根據(jù)靶蛋白的半衰期和靶細(xì)胞分裂的速率來(lái)制定用藥方案，通過(guò)重復(fù)的siRNA注射來(lái)誘發(fā)持續(xù)的基因沉默效應(yīng)。Bartlett D W等［23］還進(jìn)一步將他們的數(shù)學(xué)模型用于多項(xiàng)體內(nèi)和體外的以陽(yáng)離子環(huán)糊精為基礎(chǔ)的siRNA納米顆粒的基因沉默研究，用以提供更多的信息幫助設(shè)計(jì)更為有效的siRNA運(yùn)輸策略。

Vandenbroucke R E等［24］通過(guò)對(duì)數(shù)學(xué)模型的分析建立了體內(nèi)siRNA按時(shí)間控制釋放入細(xì)胞質(zhì)的方法。他們運(yùn)用帶陽(yáng)離子的能被生物降解的多聚β氨基酯類與帶負(fù)電荷的siRNA形成納米大小的靜電復(fù)合體，通過(guò)內(nèi)吞作用攝入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子聚合物被水解，它們降解產(chǎn)物的積累會(huì)增加內(nèi)吞小泡內(nèi)的滲透壓。當(dāng)超過(guò)一定的壓力極限時(shí)，內(nèi)吞小泡會(huì)破裂。據(jù)猜測(cè)，聚合物的降解速率和單個(gè)內(nèi)吞小泡內(nèi)聚合物的數(shù)量會(huì)控制內(nèi)吞小泡膜上滲透壓的增長(zhǎng)速率，因此，并不是所有的內(nèi)吞小泡在同一時(shí)間破裂。通過(guò)這種方式，siRNA可依賴于聚合物的降解不斷地釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引起較長(zhǎng)久的基因沉默效率。

與以上的方法相似，Raemdonck K等［25］還設(shè)計(jì)了浸有siRNA的微膠，通過(guò)水凝膠交聯(lián)的水解引起其內(nèi)包含的siRNA按時(shí)間控制釋放。根據(jù)水凝膠的特性，siRNA的釋放時(shí)間可以被隨機(jī)調(diào)整，可以是幾小時(shí)，幾天，甚至幾個(gè)星期。因?yàn)檫@種凝膠可被靶細(xì)胞攝取，它們可以作為細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存siRNA的倉(cāng)庫(kù)，緩慢地降解，并釋放其內(nèi)包含的siRNA，引起較長(zhǎng)久的基因沉默效應(yīng)。

5 展望

RNAi技術(shù)由于其高效性和高度特異性，已成為頗為理想的細(xì)胞水平基因敲除工具，并迅速成為后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)研究中不可或缺的重要手段。然而，在RNA干擾試驗(yàn)積累的經(jīng)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在RNAi發(fā)揮基因沉默效能的過(guò)程中，從siRNA類型的選擇、siRNA向體內(nèi)的遞送直至siRNA進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生干擾效應(yīng)等各個(gè)環(huán)節(jié)，許多因素都會(huì)直接或間接的影響最終的沉默效率和沉默時(shí)間。隨著對(duì)這些因素的深入研究，必將會(huì)一一克服所有的困難和障礙，使RNAi技術(shù)在不久的將來(lái)得到普遍的應(yīng)用。

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