腸道菌群對動物腸黏膜免疫的調(diào)控作用

雷春龍 董國忠

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶市牧草與草食家畜重點實驗室，重慶 400716)

腸道是動物機體與外界環(huán)境接觸最為密切的組織之一，也是機體最大的免疫器官。腸黏膜中分布著機體50%以上的淋巴組織，而腸道中共生著大量結(jié)構(gòu)復(fù)雜的菌群。近年來，在腸道菌群對動物的營養(yǎng)調(diào)控作用受到人們關(guān)注的同時，腸道菌群調(diào)控下的腸黏膜系統(tǒng)對動物的免疫與健康作用也日益引起研究者的高度重視。腸道正常菌群和腸黏膜結(jié)合形成的機械屏障、免疫屏障與生物屏障不僅發(fā)揮著保持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用，而且能有效防止致病物質(zhì)的入侵和菌群內(nèi)毒素的位移。同時，腸道菌群通過一系列生理作用對腸黏膜免疫功能進行動態(tài)調(diào)控。本文就腸道菌群的定植與特性、腸黏膜免疫細胞的功能以及腸道菌群對腸黏膜屏障與免疫功能的調(diào)控作用進行綜述，旨在為益生素制劑和黏膜口服疫苗的開發(fā)利用提供理論參考，以促進動物健康和提高生產(chǎn)性能。

1 動物腸道菌群的定植與特性

動物腸道中的菌群是一個獨特、多樣的生態(tài)系統(tǒng)，也是已發(fā)現(xiàn)的生態(tài)系統(tǒng)中細胞密度較高的系統(tǒng)之一。該系統(tǒng)中棲息著大約30屬的500多種菌群，主要由專性厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌組成，其中專性厭氧菌占99%以上，僅類桿菌和雙歧桿菌就占細菌總數(shù)的90%以上［1］。動物腸道原籍菌群主要來源于母體及其陰道，在消化道內(nèi)的定植順序首先是需氧菌，然后是兼性厭氧菌，最后才是專性厭氧菌。這些腸道菌群在動物出生后最初的種類和數(shù)量極少，新生動物從富含母體菌群的環(huán)境中獲得腸道菌系，并且隨著外源菌的不斷侵入，在腸道內(nèi)迅速形成一個龐大的菌群［2］。定植后的菌群生活在3個完全不同的微生態(tài)環(huán)境中，即有的生活在腔道內(nèi)，有的生活在腸上皮細胞(iEC)表面，有的生活在腸黏膜隱窩內(nèi)。其中定植于腸上皮細胞表面和腸黏膜隱窩內(nèi)的菌群多數(shù)是原籍菌群，其深層主要寄居著厭氧菌，中層為類桿菌、消化鏈球菌，表層為大腸桿菌、腸球菌等，它們都與宿主的腸黏膜免疫細胞有著極為密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，給剛出生的無菌小豬接種非致病性大腸桿菌，在最初幾天即可觀察到腸黏膜通透性增加、一些菌群移位到腸系膜淋巴結(jié)、產(chǎn)生特異性抗菌抗體以及多克隆的B細胞被激活等生理現(xiàn)象［3］。

2 腸黏膜免疫細胞的功能

腸道不僅是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的場所，還是機體內(nèi)最大的菌群和毒素貯存庫。正常腸道之所以能將數(shù)量巨大的細菌和毒素等有害物質(zhì)有效地局限于腸道內(nèi)，是因為腸道黏膜免疫系統(tǒng)通過誘導(dǎo)部位和效應(yīng)部位的細胞共同發(fā)揮著生理效應(yīng)，產(chǎn)生多方面、多層次的免疫防護功能［4］。

2.1 誘導(dǎo)部位細胞的功能

腸上皮細胞和派氏集合淋巴結(jié)(PP)淋巴細胞是腸黏膜免疫的主要誘導(dǎo)部位細胞。腸上皮細胞除具有消化吸收功能外，還具有攝取和釋放分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、提呈抗原和分泌細胞因子等免疫功能。近年的研究發(fā)現(xiàn)，腸上皮細胞對口服耐受(OT)也具有重要的調(diào)控作用，當(dāng)腸上皮細胞來源的轉(zhuǎn)化生長因子－α(TGF－α)被激活后，可抑制白細胞介素－4(IL－4)的反應(yīng)，從而抑制局部腸腔抗原的超敏反應(yīng)。這是因為IL－4可以誘導(dǎo)B細胞轉(zhuǎn)化為分泌型免疫球蛋白E(SIgE)，同時還可以促進肥大細胞的生長［5］。此外，研究者對腸上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)也做了深入研究。Cerutti等［6］研究發(fā)現(xiàn)，腸道單層上皮的通透性主要取決于具有連接緊密、有效封閉的頂端腸上皮細胞的能力，而腸上皮細胞的間隙恰被一種叫做內(nèi)嵌蛋白的物質(zhì)所占據(jù)，此蛋白能結(jié)合到緊密連接蛋白－1(ZO－1)上，ZO－1能將其連接到網(wǎng)狀的細胞骨架上。PP是由眾多B細胞組成的小腸黏膜淋巴濾泡組織，而B細胞是構(gòu)成SIgA和少量免疫球蛋白E(IgE)的前體細胞，PP作為腸道特異性免疫反應(yīng)的主要場所，不但在腸黏膜屏障保護功能中發(fā)揮著重要作用，同時對腸道菌群平衡具有調(diào)節(jié)作用［7］。

2.2 效應(yīng)部位細胞的功能

腸黏膜免疫的效應(yīng)部位細胞主要包括腸上皮內(nèi)淋巴細胞(iIEL)、固有層淋巴細胞(LPL)和一些相關(guān)的外分泌腺細胞。腸上皮內(nèi)淋巴細胞是動物體內(nèi)最大的淋巴細胞群，在腸道免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著主力軍的作用。但其具體生理功能目前尚不十分清楚，推測腸上皮內(nèi)淋巴細胞的功能代表一種原始的免疫防御機制，主要功能是識別來自病原體的非多肽性抗原和腸道組織損壞的細胞產(chǎn)物。Camerini等［8］將外周淋巴結(jié)的淋巴細胞移植到重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCLD)小鼠上進行試驗，觀察其小腸時發(fā)現(xiàn)，來源于胸腺的成熟T細胞可移行到小腸，并在小腸環(huán)境中分化為有特殊功能的腸上皮內(nèi)淋巴細胞，但SCLD受體鼠的腸道菌群數(shù)量很少，腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量也很少。據(jù)此推測，腸上皮內(nèi)淋巴細胞可能與位于固有層的腸道菌群抗原有關(guān)。另外一種效應(yīng)部位細胞固有層淋巴細胞彌散地分布于腸道黏膜的固有層內(nèi)，主要為CD4+T細胞和SIgA。其中CD4+T細胞能分泌白細胞介素－10(IL－10)和轉(zhuǎn)化生長因子－β(TGF－β)等下調(diào)免疫反應(yīng)的細胞因子，同時可影響SIgA+B細胞對SIgA的分泌;而SIgA+B細胞則主要通過SIgA發(fā)揮免疫效應(yīng)，能夠和病原菌、毒素及抗原性物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，從而阻止腸道有害菌的入侵和抗原性物質(zhì)滲透過腸黏膜屏障［9］。

3 腸道菌群對腸黏膜屏障功能的調(diào)控作用

腸黏膜屏障包括機械屏障、免疫屏障與生物屏障，其中機械屏障由腸上皮細胞、細胞間緊密連接蛋白(ZO)與菌膜三者構(gòu)成;免疫屏障由免疫球蛋白與免疫活性細胞、細胞因子等共同組成;生物屏障由腸道菌群和腸上皮細胞結(jié)合產(chǎn)生的黏蛋白、活性肽等共同組成。

3.1 對機械屏障的調(diào)控作用

人們在研究中逐步發(fā)現(xiàn)，腸道菌群對腸黏膜機械屏障的調(diào)控具有多種途徑。第1種途徑是腸道正常菌群通過腸上皮細胞間ZO進行調(diào)控。其中，ZO－1與緊密連接蛋白 －2(ZO－2)是腸黏膜機械屏障的重要組成部分。腸道中的大腸桿菌Nissle 1917可以通過上調(diào)ZO－1的表達，減輕腸上皮的通透性［10］;同時通過上調(diào) ZO－2的表達，保護與修復(fù)由腸上皮細胞形成的機械屏障［11］。Lindfors等［12］在乳糜瀉患者治療的研究中發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌可以有效減少由小麥醇溶蛋白引起的結(jié)腸上皮細胞的細胞膜皺折，并通過對ZO－1表達情況的檢測，證實了其對結(jié)腸上皮細胞間緊密連接的修復(fù)作用。第2種途徑是有益菌對病原菌的定植產(chǎn)生阻抗作用。腸道黏液層中的糖蛋白可與病原菌競爭腸上皮細胞中的黏附素受體，從而抑制病原菌在腸道內(nèi)的黏附、定植。有試驗表明，乳酸桿菌Bar13表現(xiàn)出了很強的定植阻抗作用，能將90%的豬霍亂沙門氏菌和68%的大腸桿菌H10407從定植部位移除［13］。第3種途徑是通過腸道菌群抑制腸上皮細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳酸桿菌GG分泌的p75和p40蛋白可激活丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測途徑，從而抑制誘導(dǎo)腸上皮細胞凋亡的細胞因子的產(chǎn)生，并促進結(jié)腸上皮細胞的生長;同時腫瘤壞死因子(TNF)導(dǎo)致的結(jié)腸上皮損傷亦明顯減少［14］。

此外，腸道菌群也可通過酵解作用產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(SCFA)間接促進腸黏膜的修復(fù)和生長。SCFA通過對腸黏膜提供能量，改善組織的局部供血，促進腸上皮細胞的修復(fù)和增加胰液中胰酶的分泌量來促進腸道的生長［15］，這可能是腸道菌群促進腸黏膜修復(fù)和生長的主要途徑。

3.2 對免疫屏障和生物屏障的調(diào)控作用

腸道正常菌群對腸黏膜免疫屏障功能的調(diào)控扮演著雙重角色。一方面，作為抗原對腸黏膜存在潛在的危害;另一方面，腸內(nèi)寄生菌可為腸黏膜細胞提供某些營養(yǎng)成分，維持腸道菌群平衡，激活腸道免疫系統(tǒng)［16］。Gauffin 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，用乳酸桿菌作為食品添加劑飼喂因營養(yǎng)狀況不良而導(dǎo)致腸黏膜屏障和免疫功能有一定損傷的小鼠，觀察其小腸免疫球蛋白分泌細胞、上皮層內(nèi)淋巴細胞和桿細胞等的結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂乳酸桿菌后小鼠的腸黏膜免疫屏障功能得到較好的恢復(fù)。研究表明，腸道菌群對免疫屏障的調(diào)控機制可能在于腸黏膜上皮中過量的糖類物質(zhì)充當(dāng)著某些致病菌的特異性免疫受體;同時，一些乳糖的存在能促進乳酸桿菌的大量增殖，并顯著減少和抑制沙門氏菌在腸上皮細胞的定植［18］。

腸道正常菌群同時能夠?qū)ι锲琳袭a(chǎn)生保護作用。一些菌群和腸道黏膜上皮細胞結(jié)合產(chǎn)生的抗菌肽和黏蛋白具有非特異性或先天防御功能，其中黏蛋白可在腸上皮表面形成黏液層并捕獲病原菌，以防止其與腸上皮表面接觸［19］。研究發(fā)現(xiàn)，黏液層中的糖蛋白本身的結(jié)構(gòu)和帶有負電荷的特性有利于包裹細菌;黏液糖蛋白暴露的化學(xué)基團與腸上皮表面結(jié)構(gòu)相似，易于細菌的識別和黏附［20］。但是，腸黏膜與菌群結(jié)合產(chǎn)生的抗菌肽與以克隆選擇為基礎(chǔ)的典型免疫防御機制不同，抗菌肽產(chǎn)生的免疫防御機制是通過無記憶而獲得的天然免疫，這種免疫功能可在宿主被感染后的極短時間內(nèi)控制、延緩甚至阻止細菌的生長［21］。研究發(fā)現(xiàn)，一些共生菌可以調(diào)控某些對腸黏膜屏障功能起重要作用的基因的表達，包括腸道上皮細胞的成熟與分化、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)的形成及異化合成代謝等基因的表達［16］，但其基因表達機制尚不完全清楚。

4 腸道菌群對腸黏膜免疫功能的調(diào)控作用

4.1 刺激特異性SIgA的產(chǎn)生

SIgA是腸黏膜細胞內(nèi)分泌量最多的免疫球蛋白。然而SIgA的生成是在腸道抗原，特別是在菌群進入腸道后的刺激作用下逐漸增加的，腸道菌群在定植后不斷向腸系膜淋巴結(jié)遷移，但遷移的細菌數(shù)量隨著SIgA引起的特異性反應(yīng)而減少，這些現(xiàn)象反映了腸道免疫屏障機制的成熟［22］。Monica等［23］研究了益生菌、寡果糖和合生元(SYN)對小鼠腸道免疫的影響，發(fā)現(xiàn)SYN使回腸產(chǎn)生的SIgA顯著增加，益生菌使PP產(chǎn)生的IL－10和盲腸內(nèi)SIgA含量顯著增加。Jalil等［24］給犬飼喂腸球菌孢子后發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)的免疫球蛋白A(IgA)含量顯著增加。鑒于此，有學(xué)者推測，在一些外源有害菌或病毒引起腸道感染時，腸道內(nèi)的IgA比血液中的免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)具有更大的保護作用［25］。因此，當(dāng)腸上皮細胞釋放到腸腔內(nèi)的SIgA和腸黏膜表面的正常菌群混合存在時，可以降低致病菌在黏膜表面的附著，中和細菌毒素并使其凝集，從而限制腸道致病菌的繁殖，以維持腸道菌群的平衡。

4.2 活化腸黏膜免疫抗原提呈通路

樹突狀細胞(DCs)是PP圓頂區(qū)(SED)產(chǎn)生的目前已知的最強有力的一種抗原提呈細胞(APC)，也是腸黏膜免疫中特殊的專職抗原提呈細胞。正常情況下，DCs處于休眠的未成熟狀態(tài)，具有很強的細胞吞噬能力，能夠高表達可捕獲抗原的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，低表達能與輔助性T細胞(Th)受體結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同作用的協(xié)同刺激分子(CM);一旦被外源菌活化，DCs便開始成熟，此時失去吞噬能力，但同時激活抗原加工機制，細胞表面開始呈現(xiàn)能夠捕獲抗原的MHC，然后在MHC刺激下腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、白細胞介素 － β(IL－β)和白細胞介素 －12(IL－12)等細胞因子開始合成［22］。此后，有益菌群(如乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌)根據(jù)菌量的變化，通過表層蛋白與DCs的結(jié)合來調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫功能，其主要機制為:有益菌群及其表面復(fù)合物與DCs間相互作用產(chǎn)生的兩者間濃度比例的高低變化，使抗炎細胞因子表達發(fā)生由高到低的變化，促炎細胞因子發(fā)生由低到高的反向變化［26］。Christensen等［9］為探究益生菌對腸道黏膜免疫活化作用而對DCs進行了深入研究，他們將從小鼠骨髓中分離的DCs與不同量的放射致死的乳桿菌共同培養(yǎng)，測定其共同培養(yǎng)物中白細胞介素 －6(IL－6)、IL－10、IL－12 和 TNF－α 的量，結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同乳桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生IL－12和TNF－α的能力不同，而產(chǎn)生IL－10、IL－6的能力差別較小;所有乳桿菌都能上調(diào)細胞表面分子主要組織相容性復(fù)合體－Ⅱ類(MHC－Ⅱ)和CD86的表達，而后者量的增加代表了DCs的成熟。

綜合以上分析表明，非淋巴外周組織中的DCs(iDCs)是引起腸黏膜免疫反應(yīng)與耐受的基礎(chǔ)，其關(guān)鍵機制是:iDCs表面只表達MHC，抑制了能與Th協(xié)同作用產(chǎn)生具有活化T細胞第2信號的關(guān)鍵分子 CM的表達［27］。但值得注意的是，iDCs被激活后成熟的DCs對外源病原菌的識別僅依賴于一種高度保守的結(jié)構(gòu)基序——病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，包括腸道菌群的脂多糖、肽聚糖、C－型凝集素和甘露糖受體等［28］。由此可見，腸道菌群對活化腸黏膜免疫抗原提呈通路起著關(guān)鍵性的作用。

4.3 調(diào)控腸黏膜免疫口服耐受現(xiàn)象

外周淋巴組織中成熟的淋巴細胞對曾經(jīng)口服過的抗原會產(chǎn)生的一種無功能性或低反應(yīng)的周圍性耐受，這種現(xiàn)象稱為口服耐受。研究發(fā)現(xiàn)，無菌動物不能產(chǎn)生口服耐受，當(dāng)注入輔助性T細胞3(Th3)和調(diào)節(jié)性T細胞(Tr)使動物產(chǎn)生TGF－β和IL－10 后，卻可誘導(dǎo)無菌動物口服耐受產(chǎn)生［29］。Kirjavainen等［30］在研究過敏性疾病時發(fā)現(xiàn)，外源菌導(dǎo)致食物過敏時會導(dǎo)致腸上皮細胞結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)過敏原的抗原提呈增加和口服耐受誘導(dǎo)減弱等現(xiàn)象。Duchmann等［31］報道指出，健康個體對自身的菌群耐受，而炎性腸病患者則不能耐受，但炎性腸病患者經(jīng)過使用益生菌治療后可以變得耐受，并且可以逆轉(zhuǎn)一些免疫失調(diào)。

目前，對腸道菌群調(diào)控腸黏膜口服耐受的機制和參與的細胞因子已有所了解。當(dāng)感染外源菌的動物產(chǎn)生口服耐受現(xiàn)象后，腸黏膜免疫反應(yīng)中輔助性T細胞1(Th1)與輔助性T細胞2(Th2)的比例有調(diào)控免疫方向的作用，Th1可上調(diào)免疫反應(yīng)，Th2則可下調(diào)免疫反應(yīng)。同時，在腸道相關(guān)淋巴組織中存在的Th3分泌的TGF－β也可下調(diào)免疫反應(yīng)。因此，腸黏膜通過調(diào)節(jié)Th1與Th2的比例來 調(diào) 控 免 疫 耐 受［32］。Duga 等［33］運 用 敲 除MHC－Ⅱ、CD 4和 IL－10等基因的小鼠進行試驗，發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生炎癥性腸炎反應(yīng);而后給小鼠口服某種菌群抗原后，針對該抗原的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)發(fā)生下調(diào)，呈現(xiàn)口服免疫耐受現(xiàn)象，但在缺乏MHC－Ⅱ或IL－10基因的基因敲除動物中不能觀察到此現(xiàn)象。同時應(yīng)用抗CD4的單克隆抗體處理其他動物也有類似情況。由此推測，MHC－Ⅱ、CD4和IL－10等是參與動物腸黏膜免疫耐受過程的細胞因子。

4.4 激活腸黏膜免疫細胞因子與免疫應(yīng)答

免疫調(diào)節(jié)的主要機制是免疫系統(tǒng)中的免疫細胞和免疫分子之間以及與其他系統(tǒng)(如神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng))之間的相互作用，使得免疫應(yīng)答以最恰當(dāng)?shù)男问骄S持在最適當(dāng)?shù)乃健Ｄc道黏膜隱窩處起始部位菌群密度升高時，可以激活隱窩內(nèi)上皮細胞表面對Toll樣受體(TLR)分子的識別，繼而引發(fā)固有免疫反應(yīng)應(yīng)答，誘導(dǎo)PP細胞分泌抗菌肽，清除過量存在的外源病原菌［34］。Tim［35］報道指出，給雞飼喂含有益生素的飼糧，其體內(nèi)的淋巴細胞數(shù)量、干擾素細胞因子濃度以及伴隨球蟲誘發(fā)下的卵囊數(shù)量發(fā)生顯著變化。

此外，研究者運用小動物對上述機制進行了大量的模型試驗。Medici等［36］通過給小鼠飼喂含益生菌的奶酪來觀察益生菌對腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)小鼠大腸和小腸的IgA+B細胞和CD4+T細胞的數(shù)量顯著增加，CD8+T細胞的數(shù)量也有一定增加，同時腸道菌群的數(shù)量也發(fā)生了變化。Demoreno等［37］在給小鼠灌注含有益生菌的發(fā)酵乳的研究中發(fā)現(xiàn)，腸道分泌的腫瘤壞死因子 － σ(TNF－σ)、干擾素 － γ(IFN－γ)和白細胞介素－2(IL－2)等細胞因子的濃度顯著增加，固有層中CD4+T細胞和CD8+T細胞的數(shù)量也顯著增加。Ma等［38］利用含有被極化的T84模型細胞來模擬結(jié)腸上皮細胞做體外培養(yǎng)試驗，發(fā)現(xiàn)致病性沙門氏菌或TNF－α能引發(fā)一些非致病性沙門氏菌和羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuter)減弱腸黏膜細胞對白細胞介素－8(IL－8)的分泌作用。Dogi等［39］研究發(fā)現(xiàn)，一些菌株能顯著增加IgA+B細胞的數(shù)量，其中革蘭氏陽性菌能夠增加IL－10分泌細胞的數(shù)量，革蘭氏陰性菌則能夠增加IL－12分泌細胞的數(shù)量。Hansen等［40］在檢測IL－10分泌量不足小鼠的腸道時發(fā)現(xiàn)，其腸道菌群的多樣性降低;在檢測患有結(jié)腸炎導(dǎo)致腸黏膜免疫受到損傷小鼠的腸道時發(fā)現(xiàn)，其腸道放線菌、蛋白菌、大腸桿菌等的數(shù)量增加，而產(chǎn)氣芽孢梭菌等的數(shù)量大量減少。由此可見，腸道菌群通過激活腸黏膜免疫細胞因子與免疫應(yīng)答這一機制而對腸黏膜免疫發(fā)揮著重要調(diào)控作用。

5 小 結(jié)

近年來，腸道菌群在調(diào)控腸道黏膜屏障與免疫功能中發(fā)揮的重要作用及其機制正日益受到研究者的高度重視。目前，國內(nèi)外學(xué)者對腸道菌群與腸黏膜免疫互作調(diào)控機制的研究還處于初級階段，許多問題尚待進一步深入探討。例如，一些共生菌對腸道屏障功能起調(diào)控作用的基因的表達機制尚不完全清楚;各類腸道菌群激活免疫應(yīng)答的途徑還不明確。同時，腸道菌群在腸道黏膜中的協(xié)同作用也是極其復(fù)雜的。因此，利用現(xiàn)代營養(yǎng)與免疫學(xué)、分子生物學(xué)等研究手段，對腸道菌群的代謝利用途徑、免疫調(diào)控機制和基因的表達機制等做深入的研究，將是未來的重點發(fā)展方向。

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