牦牛乳脂肪球膜組成分析及蛋白熱穩(wěn)定性

何勝華，馬 鶯，崔艷華，李海梅，董愛(ài)軍

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，150090 哈爾濱)

乳脂肪球(MFG)以一種微小的球狀物存在于奶中，直徑約0.2 ～15.0 μm［1］，外面被一層很薄的膜包圍，這層膜稱(chēng)為乳脂肪球膜(MFGM)［2］.MFGM中含有25% ～60%的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在其他奶相中含量很少，MFGM中蛋白質(zhì)占奶中總蛋白的 1% ～2%［3］.通過(guò)聚丙烯凝膠電泳(SDS－PAGE)分離牛奶MFGM中蛋白質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)7 ～8 條主要的蛋白帶［4］，如黏蛋白(MUC1)、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH/XO)、過(guò)碘酸稀夫Ⅲ(PASⅢ)、過(guò)碘酸稀夫Ⅳ(PASⅣ)、嗜乳脂蛋白(BTN)、過(guò)碘酸稀夫6/7(PAS6/7)和GTP結(jié)合蛋白(GTPrS).近幾年，MFGM原料作為一種有價(jià)值的成分應(yīng)用于食品加工新技術(shù)中，MFGM蛋白的功能特性引起廣泛興趣，特別是有報(bào)道稱(chēng)MFGM蛋白有抗癌、防止幽門(mén)螺桿菌的感染和對(duì)腦脊髓炎的自身免疫作用［5－8］.但是奶加工的一些過(guò)程，如常見(jiàn)的冷卻、加熱和均質(zhì)都會(huì)很大程度地破壞MFGM蛋白的穩(wěn)定性，其中加熱是奶加工的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，因此，研究熱處理對(duì)MFGM蛋白的穩(wěn)定性尤其重要.我國(guó)在MFGM方面的研究還處在初級(jí)階段，對(duì)奶MFGM的分離和組成及MFGM蛋白的熱穩(wěn)定性幾乎沒(méi)有報(bào)道.

牦牛乳含有較高的脂肪(5% ～8%)，而且脂肪球粒徑較大(4.39 μm)，很適合分離奶油及MFGM.本文主要從牦牛乳脂肪中提取分離MFGM，通過(guò)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecylsulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)確定牦牛MFGM中的主要蛋白、組成及其熱穩(wěn)定性，并對(duì)牦牛MFGM蛋白的氨基酸組成進(jìn)行分析.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

麥洼牦牛奶:采自四川紅原縣;鄰苯二胺(OPD):北京索萊寶科技有限公司;唾液酸(N－乙酰神經(jīng)氨酸)標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自sigma).

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Agilent 1100型高效液相色譜儀，配備四元梯度泵，100位自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，化學(xué)工作站，離心機(jī).日立835－50型氨基酸分析儀.電泳儀:DYY－8C，北京六一儀器廠.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牦牛奶MFGM的分離提取

取新鮮牦牛乳，向每100 mL牦牛乳中加入蔗糖5 g，于42℃用小型乳脂分離機(jī)分離出奶油，將分離出的奶油不經(jīng)洗滌和用1.5 g·L－1的KCl于小型乳脂分離機(jī)中洗滌3次并收集奶油，洗滌的目的是去除附著于脂肪上的酪蛋白和乳清蛋白，洗后和未洗的奶油于4℃冷藏12 h后于42℃溶解，溶解后的奶油用攪拌器攪乳10 min，加少量去離子水，分離出黃油和酪乳.分離出的黃油于60℃加熱融化，然后加入等體積的去離子水，形成的漿液在4 kr/min離心15 min，收集上清液并與酪乳混合，用0.01 mol/L的HCl將上述合并液調(diào)至 pH4.8于室溫(25℃)凈置30 min使MFGM蛋白沉淀，于4 kr/min離心15 min收集沉淀物和懸浮的MFGM小體，向收集物中加蒸餾水并用0.01 mol/L的NaOH調(diào)至pH6.8.純化后的MFGM儲(chǔ)存于－20℃，待分析.

1.3.2 牦牛MFGM透射電鏡

將分離提純的MFGM用戊二醛在4℃固定在2.5 h以上，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS)pH7.2清洗3次，每次15 min，洗滌后用1%鋨酸固定1.5 h，接著用0.1 mol/L PBS pH7.2再清洗3次，每次15 min，洗滌后分別用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、90%的乙醇梯度脫水15 min，最后用100%乙醇脫水兩次，每次10 min.用100%乙醇與100%丙酮(體積比為1∶1)繼續(xù)脫水10 min后，再用100%丙酮脫水10 min，接著用100%丙酮與 812樹(shù)脂(體積比為 1∶1)包埋30 min，再用100%丙酮與812樹(shù)脂(體積比為1∶2)包埋2 h，梯度聚合3 d后，修塊、切成厚度為60 nm的小塊，電鏡雙重染色后進(jìn)行觀察.

1.3.3 牦牛MFGM的成分分析

牦牛MFGM的蛋白質(zhì)含量分析采用凱氏定氮法(AOAC，1974).總脂質(zhì)含量分析采用文獻(xiàn)［9］方法.己糖含量采用苯酚－硫酸法，參照文獻(xiàn)［10］.唾液酸含量采用高效液相色譜法，色譜條件為:色譜柱，Agilent TC－C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫，35 ℃;流動(dòng)相，1.0% 四氫呋喃水溶液(含0.2% 磷酸)－乙腈(體積比為92∶8);檢測(cè)波長(zhǎng)，230 nm;流速，1.0 mL/min;進(jìn)樣體積，10 μL.

樣品處理:準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g牦牛奶MFGM，用濃度為0.1 mol/L的硫酸溶液8 mL水解，在水浴鍋中80℃條件下水解 2 h，取出后冷卻，于4 kr/min離心15 min，取上清液調(diào)pH值至4～6，將濾液定容至10 mL，用移液管準(zhǔn)確移取2 mL濾液，加入10g/L鄰苯二氨鹽酸鹽溶液(用0.2 mol/L硫酸氫鈉溶液溶解)1 mL，再置于80℃水浴鍋中加熱 30 min，取出后冷卻，經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾后精密吸取上述溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積.以唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出唾液酸的含量;牦牛MFGM灰分含量的測(cè)定通過(guò)用馬福爐于550℃灼燒完全后質(zhì)量的變化來(lái)計(jì)算.

1.3.4 牦牛MFGM蛋白的SDS－PAGE分析

將分離的牦牛MFGM用上樣液稀釋后，取10 μL上樣于15%的SDS-PAGE，電泳槽開(kāi)始電壓穩(wěn)定在85 V，進(jìn)入分離膠后電壓穩(wěn)定在120 V，分離的蛋白用考馬斯亮蘭染色1 h，然后用脫色液(V(冰乙酸)∶V(無(wú)水乙醇)∶V(水)=100∶50∶850)進(jìn)行脫色，最后經(jīng)凝膠成像獲得MFGM蛋白分離圖.

1.3.5 牦牛MFGM蛋白的熱穩(wěn)定性

新鮮的牦牛奶脂肪經(jīng)KCl洗滌1次后分別在40、50、60、70 和80 ℃加熱 15 min，冷卻至室溫后按照1.3.1的方法提取分離牦牛MFGM，在提取過(guò)程中不再需要用KCl洗滌脂肪，目的是觀察牦牛MFGM蛋白和牦牛乳中酪蛋白和乳清蛋白的相互作用.以不加熱為對(duì)照組.分離的MFGM蛋白進(jìn)行SDS－PAGE(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15%的濃縮膠和5%的分離膠)分析.

1.3.6 牦牛乳MFGM的氨基酸分析

應(yīng)用日立835－50型氨基酸分析儀附可見(jiàn)光檢測(cè)器進(jìn)行氨基酸的測(cè)定.色譜條件:分析柱為150 mm，Φ4.0不銹鋼柱(2169#樹(shù)脂);去氨柱，120 mm，Φ4.0不銹鋼柱(2150#樹(shù)脂).泵1流速為0.55 mL/min(壓力為90～140 kg/cm2);柱溫58℃，反應(yīng)盤(pán)溫度100℃.采用外標(biāo)法進(jìn)行定量.樣品制備采取蛋白質(zhì)保護(hù)性氧化酸水解法.

2 結(jié)果與討論

2.1 牦牛MFGM的分離及透射電鏡

MFGM的分離主要有物理和化學(xué)分離兩種方法，物理方法主要是分離的乳脂肪經(jīng)過(guò)KCl洗滌后，通過(guò)反復(fù)的冷凍和溶解，最后通過(guò)攪打使MFGM從MFG上脫落并釋放出來(lái)進(jìn)入水相，再通過(guò)沉淀和高速離心收集MFGM.化學(xué)方法是通過(guò)利用極性對(duì)質(zhì)子惰性溶劑、膽汁鹽或非離子型洗滌劑使MFGM直接釋放出來(lái).但是直接提取可導(dǎo)致MFGM得率偏低，另外應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)的濃度、提取的時(shí)間和溫度也可以造成MFGM組分在一定程度上發(fā)生變化.

圖1是牦牛乳脂肪洗滌前和洗滌后分離的MFGM蛋白的 SDS-PAGE圖.可以看出，牦牛MFGM蛋白主要由一些分子質(zhì)量較大的蛋白(47.8～225.6 ku)組成，主要有 5種:黏蛋白(MUC1)，分子質(zhì)量為225.6 ku，該蛋白的分子質(zhì)量在牛奶、羊奶和牦牛奶中存在一些差別，不同品種的奶MFGM，該蛋白的分子質(zhì)量可能不一樣，但其范圍在170～225 ku;黃嘌呤脫氫酶(XO)，分子質(zhì)量為157.4 ku，該物質(zhì)有較強(qiáng)的抑菌作用;過(guò)碘酸稀夫III/IV的分子質(zhì)量為78～98 ku，模糊的PAS III/IV蛋白條帶顯示了較低的濃度，主要是PAS III/IV蛋白與 MFGM結(jié)合較松，而且是MFGM的外圍蛋白，很容易被KCl溶液洗滌下來(lái)而損失掉;嗜乳脂蛋白(BUT)，分子質(zhì)量為67.5 ku、類(lèi)似的蛋白在母乳中也被分離和發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量在67～70 ku.過(guò)碘酸稀夫6(PAS6)和過(guò)碘酸稀夫7(PAS7)，分子質(zhì)量分別為50.2 ku和47.8 ku.

本實(shí)驗(yàn)對(duì)牦牛MFGM的分離采用物理分離法，圖1(a)，(b)是MFGM在分離之前未經(jīng)過(guò)KCl洗滌脂肪和經(jīng)過(guò)KCl洗滌脂肪3次后的MFGM蛋白的SDS-PAGE圖.可以看出，未經(jīng)過(guò)KCl洗滌脂肪分離的MFGM含有大量的酪蛋白，而經(jīng)過(guò)KCl洗滌3次后的MFGM的酪蛋白含量明顯減少.但是與MFGM結(jié)合較松的過(guò)碘酸稀夫Ⅲ(PASⅢ)和過(guò)碘酸稀夫Ⅳ(PASⅣ)經(jīng)過(guò)KCl洗滌后含量有所下降.因此，KCl溶液洗滌3次比較合適.

圖1 牦牛乳脂肪洗滌前后分離的MFGM聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖2是牦牛MFGM的透射電鏡圖(TEM)，可以看出，MFGM片段是折疊的和無(wú)規(guī)則的，在MFGM上還是結(jié)合了一部分酪蛋白膠束，雖然這種結(jié)合看起來(lái)是簡(jiǎn)單的物理結(jié)合，但酪蛋白也有可能與MFGM通過(guò)化學(xué)方法相互結(jié)合在一起.

圖2 牦牛MFGM的透射電鏡

2.2 牦牛乳MFGM的基本組成

牦牛MFGM的基本化學(xué)組成見(jiàn)表1，主要由蛋白質(zhì)和脂類(lèi)兩大物質(zhì)組成，其MFGM(干基)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.27±0.01)g/g，脂質(zhì)為(0.70±0.05)g/g，這兩種物質(zhì)占MFGM總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的97.27%，這一結(jié)果與Kanno和 Kim報(bào)道的牛奶MFGM中的蛋白(28%)和脂質(zhì)(64%)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本一致［11］.另外，牦牛奶 MFGM(干基)還含有(0.10±0.03)mg/g的己糖、(0.005±0.010)g/g的唾液酸和(0.006±0.010)g/g的灰分，其中唾液酸是一族神經(jīng)氨酸(neuraminic acid)的衍生物，在腦的發(fā)育和維護(hù)細(xì)胞膜、膜受體以及亞細(xì)胞器的正常生理功能中起到重要作用［12］.它參與細(xì)胞表面的多種生理功能，促進(jìn)嬰兒的記憶力和智力發(fā)育.大量的唾液酸存在于腦神經(jīng)節(jié)苷酯中，也有一些存在于外神經(jīng)系組織和體液中.記憶形成研究表明腦神經(jīng)節(jié)苷酯中的唾液酸在信息的傳遞和儲(chǔ)藏方面起著關(guān)鍵的作用［13］.另外，唾液酸是構(gòu)成細(xì)胞膜黏液素、糖蛋白和糖脂的主要成分.

表1 牦牛MFGM的基本化學(xué)組成

2.3 牦牛MFGM蛋白的熱穩(wěn)定性

加熱是奶加工過(guò)程中的一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)，有必要研究熱對(duì)牦牛MFGM蛋白穩(wěn)定性的影響.牦牛奶脂肪經(jīng)KCl洗滌1次后經(jīng)不同溫度加熱后分離的MFGM蛋白的SDS－PAGE見(jiàn)圖3.可以看出，當(dāng)加熱溫度達(dá)60℃時(shí)，MFGM蛋白特別是黃嘌呤氧化酶(XO)、過(guò)碘酸稀夫6(PAS6)和過(guò)碘酸稀夫 7(PAS7)損失較大.過(guò)碘酸稀夫6(PAS6)和過(guò)碘酸稀夫7(PAS7)似乎遷移進(jìn)入乳清中，但這種遷移機(jī)制至今不很清楚.可能是β－乳球蛋白和牦牛MFGM的復(fù)雜性改變了膜的結(jié)構(gòu)和環(huán)境，導(dǎo)致 PAS6和 PAS7的遷移和損失［14］.這種相對(duì)較溫和的溫度導(dǎo)致牦牛MFGM蛋白的損失還有待研究，然而，這種作用在40℃就能發(fā)生，原因可能是脂質(zhì)相的熔點(diǎn)在大于40℃后導(dǎo)致脂肪球表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得MFGM蛋白損失［15］.

從圖3還可以看出，β－乳球蛋白在60℃沒(méi)有損失，濃度反而有所增加，這主要是β-乳球蛋白與MFGM發(fā)生了結(jié)合.該結(jié)合溫度低于β－乳球蛋白的解鏈溫度(78℃)，β－乳球蛋白與牦牛奶MFGM結(jié)合的機(jī)制還不很清楚，但這里似乎存在一些可能的途徑.據(jù)牛奶 β－乳球蛋白與MFGM結(jié)合的文獻(xiàn)可以推斷出牦牛奶β－乳球蛋白與牦牛MFGM的結(jié)合可能通過(guò)巰基與二硫鍵的相互結(jié)合，或許是通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)或MFGM在加熱過(guò)程中被破壞，留下了空隙使乳清蛋白吸附到新暴露的脂肪球表面而使得β－乳球蛋白的濃度不斷增加［16－17］.

同樣，圖3也顯示了α－乳白蛋白在60℃也與牦牛MFGM發(fā)生了結(jié)合.也有一些關(guān)于牛奶中α－乳白蛋白與MFGM結(jié)合的報(bào)道，這種結(jié)合的發(fā)生同樣可以用來(lái)推斷牦牛奶α－乳白蛋白與牦牛MFGM的結(jié)合也可能是通過(guò)巰基二硫鍵的相互作用，該結(jié)合方式與β－乳球蛋白相似，但是牦牛奶中的酪蛋白在整個(gè)加熱過(guò)程中幾乎沒(méi)有發(fā)生變化［18］.

圖3 牦牛奶脂肪在不同加熱溫度下分離的MFGM的SDS-PAGE圖

2.4 牦牛MFGM的氨基酸組成

牦牛MFGM的氨基酸組成見(jiàn)表2，列出了牦牛MFGM的15種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù).其中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的氨基酸是谷氨酸(200.1 mg/g)，其次是亮氨酸(110.8 mg/g)，緊接著是絲氨酸(96.7 mg/g)、賴(lài)氨酸(82.6 mg/g)等，牦牛MFGM中的必需氨基酸占整個(gè)氨基酸的49.48%.非必需氨基酸占50.52%，兩者之比接近于1.0，說(shuō)明牦牛乳MFGM蛋白氨基酸組成比例較合理.

表2 牦牛MFGM蛋白的氨基酸組成

3 結(jié)論

1)采用物理方法對(duì)牦牛MFGM進(jìn)行分離，KCl溶液洗滌3次效果較好.透射電鏡(TEM)分析表明，MFGM片段是折疊的和無(wú)規(guī)則的，在MFGM上還是結(jié)合了一部分的酪蛋白膠束.

2)牦牛奶MFGM主要由蛋白質(zhì)和脂類(lèi)物質(zhì)組成，其MFGM蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.27±0.01)g/g，脂質(zhì)為(0.70±0.04)g/g，另外，牦牛MFGM還含有(0.09±0.02)mg/g的己糖、(0.005±0.010)g/g的唾液酸和0.006±0.010 g/g的灰分.

3)牦牛MFGM蛋白中的黃嘌呤氧化酶(XO)、過(guò)碘酸稀夫6(PAS6)和過(guò)碘酸稀夫7(PAS7)加熱到60℃損失較大.另外，β－乳球蛋白和α－乳白蛋白在60℃開(kāi)始與牦牛MFGM結(jié)合，隨著溫度升高，結(jié)合量不斷增加.

4)牦牛奶中主要的氨基酸是谷氨酸、亮氨酸、絲氨酸、賴(lài)氨酸等，其中必需氨基酸占整個(gè)氨基酸的49.48%.

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