韓磊 張曉玲 唐國華
(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔正畸科,南京210025;2.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所 骨科細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 口腔正畸科,上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200011)
牙槽骨和顱頜面骨是應(yīng)力豐富區(qū),也是成骨細(xì)胞活躍區(qū)。在外界機(jī)械應(yīng)力刺激下,成骨細(xì)胞的增殖分化是骨組織發(fā)生適應(yīng)性改建和骨再生重建的源泉[1]。越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)牽張力是有效促進(jìn)成骨細(xì)胞活性和功能的力學(xué)刺激。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn):與力學(xué)有關(guān)的信號包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1/2(extracellular regulated protein kinases-1/2,ERK-1/2)信號通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)信號通路、促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPK)信號通路、鈣離子通道、Rho蛋白及相關(guān)蛋白激酶(Rho/Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,Rho/ROCK)通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)通路、Hedgehog通道、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)通路等?;仡櫯cHedgehog相關(guān)的一些研究,筆者了解到在脊椎動物中,Hedgehog(Hh)蛋白家族至少含有3種成員,分別為Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Dersert Hedgehog(Dhh)[2]。所有的Hh蛋白均可通過自身裂解過程產(chǎn)生一個C末端和功能性N末端結(jié)構(gòu)域,并且裂解的部位相當(dāng)保守。Ihh與Shh的C末端有明顯的區(qū)別,而N端結(jié)構(gòu)93%一致,故兩者有相似的生物學(xué)作用[3]。Hh受體Patched(Ptch)為一類12通道的跨膜蛋白,Hedgehog信號的傳導(dǎo)通過Smoothened(Smo,一類G蛋白偶聯(lián)的多通道膜蛋白)而發(fā)揮作用。缺乏Hedgehog蛋白時,Smo與Ptch結(jié)合處于抑制狀態(tài)。當(dāng)Hedgehog蛋白與Ptch結(jié)合后導(dǎo)致Smo釋放,活性狀態(tài)的Smo激活目的基因的轉(zhuǎn)錄活性,最終誘導(dǎo)一系列下游信號分子的釋放,發(fā)揮其調(diào)控作用[3-4]。Hedgehog通道抑制劑環(huán)巴胺(cyclopamine,cy)是一種植物性甾體類生物堿,主要通過對抗Smo而抑制Hh信號通路[5]。Hedgehog信號參與調(diào)節(jié)骨的生長發(fā)育,其中Ihh對經(jīng)歷軟骨內(nèi)成骨的四肢骨及大部分顱面骨的作用明顯。Ihh在軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和分化中起調(diào)節(jié)作用[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):Ihh在成骨細(xì)胞中也有表達(dá)[6]。同時研究表明:Ihh是一個機(jī)械傳導(dǎo)因子,在下頜前導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,牽張力會激發(fā)下頜髁突增殖層細(xì)胞Ihh的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞的增殖[7]?;诖?,筆者提出假設(shè):Hedgehog信號可能在機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖中發(fā)揮調(diào)控作用。因此本實(shí)驗(yàn)的研究目的是通過建立成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)加力模型,研究牽張力下Hedgehog家族中Ihh對成骨細(xì)胞增殖的作用,從而探索機(jī)械應(yīng)力對成骨細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制。
新生SD大鼠(中國科學(xué)院斯萊克動物中心),鼠N端Hedgehog重組蛋白(N-terminus Sonic Hedgehog,N-Shh)(R&D公司,美國),環(huán)巴胺(Biomol公司,美國),三氯化釓(GdCl3)、0.25%胰酶、Ⅱ型膠原酶(Sigma公司,美國),α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司,美國),含100 U·mL-1青霉素和100 mg·mL-1鏈霉素(Invitrogen公司,加拿大)的雙抗,甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(Promega公司,美國),流式細(xì)胞儀(BD公司,美國),F(xiàn)lexcell 4000TM加力系統(tǒng)(Flexcell公司,美國)。
1.2.1 成骨細(xì)胞的分離鑒定 取出生不足24 h的新生SD大鼠,在無菌條件下獲取顱頂骨,采用次序性酶消化法分離成骨細(xì)胞[8-9],加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)的α-MEM培養(yǎng)基,接種于75 cm2培養(yǎng)瓶,次日吸去殘留骨片后隔日換液,細(xì)胞80%~90%匯合時傳為P1代。
1.2.2 成骨細(xì)胞加力 常規(guī)細(xì)胞復(fù)蘇,用含10%小牛血清(fetal calf serum,F(xiàn)CS)的α-MEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,隔日換液。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)85%匯合時,按照每個培養(yǎng)皿每平方厘米1×105個細(xì)胞傳代于Flexcell加力板上,細(xì)胞種板日標(biāo)記為0 d;培養(yǎng)24 h后,換無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞狀態(tài)同步化;重新加入10%FCS的α-MEM培養(yǎng)基之后,分別對成骨細(xì)胞施加變形率為3%和6%(頻率為0.5 Hz、1/2正弦波形)的循環(huán)式牽張力,作用時間分別為4、12、24、36、48、60、72 h;對照組成骨細(xì)胞未施加循環(huán)式牽張力。每個樣本有3個復(fù)孔。
1.2.3 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在3%和6%牽張應(yīng)變作用24 h后,在加力板內(nèi)加入固定液,顯微鏡觀察成骨細(xì)胞形態(tài)。
1.2.4 成骨細(xì)胞增殖能力分析 對成骨細(xì)胞施加4、12、24、36、48、60、72 h的循環(huán)式牽張力,每個樣本有3個復(fù)孔,加力結(jié)束后收樣,通過MTT比色法檢測細(xì)胞的相對數(shù)。運(yùn)用流式細(xì)胞儀技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。選擇24 h的時間點(diǎn)對成骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),在成骨細(xì)胞接種于Flexcell加力板的第2天分別加入100 ng·mL-1N-Shh和2.5 μmol·L-1cy后同步化處理,在加力前15 min分別加入10 μmol·L-1的GdCl3,加力結(jié)束后收樣檢測細(xì)胞相對數(shù)和細(xì)胞周期。
采用SAS 8.0軟件包對結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)用±s表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
取P2代細(xì)胞,培養(yǎng)1周后多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為堿性磷酸酶染色陽性;經(jīng)含β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸的培養(yǎng)基培養(yǎng),2周后可形成明顯的礦化結(jié)節(jié),茜素紅染色為鮮紅色,證實(shí)所獲得的成骨細(xì)胞具有體外成骨功能。
成骨細(xì)胞受到周期性牽張應(yīng)變作用后的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖1。在3%牽張應(yīng)變作用24 h后,加力板邊緣原來呈現(xiàn)短梭形的成骨細(xì)胞被拉長,呈成行排列,與受力方向垂直;中間部分細(xì)胞仍呈不規(guī)則排列,但細(xì)胞體積增大。6%牽張應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞形態(tài)變化與受到3%牽張應(yīng)變類似。
2.3.1 不同大小牽張應(yīng)變對成骨細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示,3%牽張應(yīng)變作用12、24、36、48 h后,加力組較對照組成骨細(xì)胞數(shù)目顯著增加,二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而在加力60、72 h后,2組細(xì)胞數(shù)目間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。6%牽張應(yīng)變下成骨細(xì)胞數(shù)目的變化趨勢與3%類似(圖2)。流式細(xì)胞儀定量檢測顯示,3%牽張應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞進(jìn)入S期的比例在加力24和48 h后分別比對照組增加了70%和20%;6%牽張應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞進(jìn)入S期的比例在24和48 h后分別比對照組增加了80%和35%。
圖2 牽張應(yīng)力對成骨細(xì)胞增殖的影響Fig 2 The effect of stretching force on cell proliferation
施加牽張應(yīng)變24 h后,與3%牽張應(yīng)變相比,6%牽張應(yīng)變對成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用更明顯(圖3、4)。當(dāng)使用GdCl3處理后,3%和6%牽張應(yīng)變均不能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖(圖3、4)。
2.3.2 Hedgehog在牽張應(yīng)變促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖中的作用 對成骨細(xì)胞施加牽張應(yīng)變24 h,細(xì)胞周期檢測顯示,Hh通道抑制劑cy抑制了6%牽張應(yīng)變對S期比例的促進(jìn)作用,使S期比例降低了40%(圖5);加入cy后,加力組較cy處理組在S期比例上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5),再加入機(jī)械通道抑制劑GdCl3后,更能抑制S期比例(P<0.05,圖5)。加入Hh通道增強(qiáng)劑N-Shh后,加力組較對照組S期比例升高(P<0.05,圖6)。成骨細(xì)胞在受到6%牽張應(yīng)變后,加入N-Shh組與不加N-Shh組在S期比例上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。
圖3 牽張應(yīng)變和GdCl3對成骨細(xì)胞數(shù)目的影響Fig 3 The effect of stretching force and GdCl3 on cell proliferation of osteoblasts
圖4 牽張應(yīng)變和GdCl3對細(xì)胞S期比例的影響Fig 4 The effect of stretching force and GdCl3 on S phase ratio
圖5 cy和GdCl3對牽張應(yīng)力下成骨細(xì)胞增殖的影響Fig 5 The effects of cy and GdCl3 on the stretch induced proliferation of osteoblasts
圖6 N-Shh對牽張應(yīng)變下成骨細(xì)胞增殖的影響Fig 6 The effect of N-Shh on the stretch induced proliferation of osteoblasts
成骨細(xì)胞是骨修復(fù)、重建過程中重要的功能細(xì)胞,具備增殖、分化、分泌骨細(xì)胞外基質(zhì)的能力[10-12]。牽張應(yīng)變促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的機(jī)理仍然不是很清楚。目前發(fā)現(xiàn)的與增殖激活有關(guān)的基因有c-Myc、c-Fos、c-Jun等[13-16]。先期研究發(fā)現(xiàn):Ihh對軟骨內(nèi)成骨過程中成骨細(xì)胞的增殖是必需的。本研究發(fā)現(xiàn):Ihh參與了成骨細(xì)胞力學(xué)傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖兩種過程。作用于成骨細(xì)胞的牽張力經(jīng)過一系列信號傳導(dǎo)促進(jìn)Ihh信號的表達(dá),Ihh信號進(jìn)一步介導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖。
本實(shí)驗(yàn)采用的Flexcell 4000TM系統(tǒng)能夠?qū)討B(tài)的、可控性強(qiáng)的力學(xué)信號作用于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果提示加力板邊緣的成骨細(xì)胞受到單軸牽張力,而加力板中央的大部分成骨細(xì)胞受到等軸牽張力。Flexcell 4000TM系統(tǒng)所施加的力學(xué)信號主要有力值大小、頻率、波形、作用時間4個重要的參數(shù)。從模擬生理環(huán)境的角度,本實(shí)驗(yàn)采用了中度變形幅度(3%和6%)、低頻(0.5 Hz)間斷刺激[10-12]。生理情況下的力通常是由無到最大值一個連續(xù)緩慢的變化過程,所以采用1/2正弦波形。在牽張應(yīng)變作用48 h內(nèi),加力組較對照組成骨細(xì)胞數(shù)目顯著增加,而在加力60、72 h后,2組細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與成骨細(xì)胞對周期性牽張應(yīng)力的作用時間(或總周期數(shù))具有“扳機(jī)點(diǎn)”效應(yīng)有關(guān)[11]。對成骨增殖周期進(jìn)行定量檢測結(jié)果顯示:受到牽張應(yīng)變后,成骨細(xì)胞處于S期比例的細(xì)胞數(shù)目增多,牽張應(yīng)力能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,并且此促進(jìn)作用主要發(fā)生在48 h內(nèi),6%牽張應(yīng)變對成骨細(xì)胞刺激較3%牽張應(yīng)變更明顯,因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,主要選取24 h,6%牽張應(yīng)變的參數(shù)。GdCl3被認(rèn)為是特異性的機(jī)械通道抑制劑[17]。當(dāng)先使用GdCl3后再施加牽張力,3%和6%牽張應(yīng)變均不能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果均證實(shí)牽張應(yīng)變能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。
筆者在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):變形率為6%的牽張應(yīng)變作用于成骨細(xì)胞4、12、24 h后,Hedgehog家族中的Ihh基因表達(dá)分別增加了20%、110%和50%,6%的牽張應(yīng)變較3%牽張應(yīng)變對Ihh基因表達(dá)的促進(jìn)作用更明顯。這提示Hedgehog家族中的Ihh信號對力學(xué)刺激敏感。使用GdCl3阻斷牽張力通道,GdCl3能完全抑制牽張力對Ihh表達(dá)的促進(jìn)作用。這提示Ihh基因?qū)αW(xué)刺激敏感,牽張應(yīng)變通過成骨細(xì)胞膜表面的機(jī)械力通道調(diào)節(jié)Ihh基因的表達(dá)?;谏鲜霭l(fā)現(xiàn),本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究Ihh信號與牽張應(yīng)變下成骨細(xì)胞增殖間的關(guān)系。
為了揭示Ihh信號在牽張應(yīng)變促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖中的作用,筆者分別觀察了Hh通道增強(qiáng)劑N-Shh、Hh通道抑制劑cy以及機(jī)械通道抑制劑GdCl3對牽張應(yīng)力下成骨細(xì)胞增殖的影響。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí):N-Shh干預(yù)成骨細(xì)胞后,其數(shù)目及處于增殖期(S期)的細(xì)胞比例增多[6]。而經(jīng)過cy處理后的細(xì)胞數(shù)量和S期細(xì)胞數(shù)均明顯減少。這提示:Hedgehog信號促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Hedgehog通道抑制劑cy不但阻斷了6%牽張應(yīng)變對S期比例的促進(jìn)作用,而且使S期比例降低了40%,這與前期的研究結(jié)果一致[6],同時也提示cy對成骨細(xì)胞增殖的抑制作用大于牽張力的促進(jìn)作用。為了進(jìn)一步研究Ihh是否是牽張應(yīng)力促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的唯一途徑,分別加入cy和(或)GdCl3。加入cy后再施加牽張力仍然能促進(jìn)細(xì)胞的增殖,但這種促進(jìn)作用能被GdCl3抑制,這提示Ihh并非是牽張應(yīng)變促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的唯一途徑,牽張力還可能通過其他通路或因子促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。
此外,加入Hh通道增強(qiáng)劑N-Shh后,加力組較對照組成骨細(xì)胞增殖增加,這也進(jìn)一步支持了牽張應(yīng)變促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的傳導(dǎo)通道可能涉及眾多的通路或因子,而Ihh僅僅是其中之一;Hh通道增強(qiáng)劑N-Shh和力學(xué)刺激共同作用也并不比單獨(dú)力學(xué)刺激更能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。這提示牽張力和N-Shh在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖上并無協(xié)同作用。
綜上所述,Ihh參與了牽張力對成骨細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié);Hedgehog通路是參與應(yīng)力對成骨細(xì)胞增殖調(diào)控的通道之一。對Hedgehog信號的調(diào)控,可能成為促進(jìn)骨形成和骨修復(fù)的又一有效途徑。
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