姚超 卜令學 王科 李寧毅 王玲玲 于躍遠
(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院 口腔頜面外科,青島266003)
組織工程的迅速興起為頜骨缺損的修復(fù)提供了新的方法和思路。組織工程必須具備種子細胞、支架與生長因子[1]。通常將種子細胞植入多孔支架材料中,但普通用胰酶消化的細胞的Na+/K+-ATP酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(glucose transporter-1,GLUT-1)、鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體-1(sodium glucose cotransporter-1,SGLT-1)、水通道蛋白等被破壞丟失,不利于其在支架上黏附、分泌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)形成骨組織結(jié)構(gòu)[2]。另外在植入過程中容易造成種子細胞丟失。筆者應(yīng)用細胞片層技術(shù)獲取種子細胞,既保留了細胞間的結(jié)構(gòu),又保留了細胞分泌的ECM,減少了種子細胞的喪失[3]。本實驗在復(fù)合血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)的聚乳酸羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]支架材料中加入骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells,BMSCs)細胞懸液,并在其表面包裹犬BMSCs細胞片層,然后植入犬的下頜骨缺損處,以期構(gòu)建具有一定正常骨結(jié)構(gòu)和功能的組織工程骨,為下頜骨缺損探討更好的修復(fù)方法。
PLGA支架(山東省醫(yī)療器械研究所),DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司,美國),rhBMP-2(Peprotech公司,美國),VEGF(Prospec公司,以色列),溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿(Nunc公司,丹麥),倒置相差顯微鏡(Olympus公司,日本),JSM-840掃描電子顯微鏡(JEOL公司,日本)。
選取由青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院實驗動物中心提供的健康雜種犬16只為研究對象,12~14個月齡,體重18~23 kg,雌雄不限。由青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院實驗動物中心在相同條件下飼養(yǎng)。
1.3.1 BMSCs的獲取、分離和培養(yǎng) 將實驗犬麻醉后抽取骨髓血10 mL,密度梯度離心法分離BMSCs。將BMSCs用培養(yǎng)液稀釋到密度為每毫升1×107個后,接種到50 mL培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察,達到80%匯合狀態(tài)時,采用0.25%胰蛋白酶(含0.02%乙二胺四乙酸)消化,以1∶2比例傳代。
1.3.2 BMSCs成骨誘導(dǎo) 將傳代培養(yǎng)的第二代細胞加入6 mL含10%胎牛血清、成骨誘導(dǎo)液[4](50 mg·L-1維生素C、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、1×10-4mmol·L-1地塞米松)的DMEM高糖培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,將BMSCs向成骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)。
1.3.3 BMSCs細胞片層的制備 采用胰蛋白酶消化經(jīng)成骨誘導(dǎo)的BMSCs,在細胞計數(shù)后以每毫升1×107個的密度接種到溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿中,放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,每3 d換液。10 d后BMSCs鋪滿培養(yǎng)皿底部,然后將培養(yǎng)皿放入20 ℃恒溫箱中30 min,BMSCs與溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿底部分離形成細胞片層。
1.3.4 PLGA支架制備 將PLGA支架修整為上底長3 cm、寬1 cm;下底長2.5 cm、寬1 cm;高1 cm的多邊體,并在背側(cè)做一30 mm×3 mm×5 mm凹槽,以備嵌入下牙槽神經(jīng)血管束。利用冷凍真空干燥法將0.1 μg·mL-1rhBMP-2和5 μg·mL-1VEGF復(fù)合到PLGA支架中,低溫消毒后,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.5 BMSCs接種和細胞片層包裹支架 將誘導(dǎo)后的BMSCs用0.25%胰酶消化,加入培養(yǎng)液終止消化后,1 000 r·min-1離心5 min,調(diào)整細胞密度,以細胞密度為每毫升1×107個植入到PLGA支架中,使支架完全浸濕,分為A、B組。A組在支架表面包裹2層BMSCs細胞片層,作為實驗組;B組不包裹BMSCs細胞片層,作為對照組。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,取部分掃描電鏡觀察。
1.3.6 動物體內(nèi)植入 將16只犬分為4組,每組4只,靜脈麻醉成功后,在兩側(cè)下頜骨體下緣各做5 cm切口,切開皮膚、筋膜及肌肉,暴露下頜骨體,在兩側(cè)下頜骨體中部各做一與支架相對應(yīng)的上寬下窄全層梯形缺損,以防植入體脫出,注意保留下牙槽神經(jīng)血管束。左側(cè)(實驗側(cè))植入支架A,右側(cè)(對照側(cè))植入支架B。將下頜神經(jīng)血管束嵌入支架凹槽中,嚴密縫合軟組織,對支架進一步固定。術(shù)后每只實驗犬每天肌注青霉素400萬U,持續(xù)7 d。
1.3.7 大體觀察、影像學檢查和組織學檢查 術(shù)后4、8、12、16周分別處死1組實驗動物,取出雙側(cè)下頜骨作大體觀察。在同樣投照條件下(電壓:51 kV,電流:4.13 mA,時間:0.04 s,投照距離:1 m)拍攝標本X線片,用image pro plus 6.0軟件分析測量光密度值。實驗側(cè)與對照側(cè)在相同部位分別切取部分標本組織,常規(guī)脫礦,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,制作組織切片,倒置相差顯微鏡下觀察。
采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,對不同組同一時間點光密度值采用配對t檢驗,對同一組不同時間點光密度值采用單因素方差分析。
BMSCs接種后4 h可觀察到少量細胞貼壁;接種后24 h,細胞呈不規(guī)則三角形。接種后10 d,細胞達到100%匯合狀態(tài),并呈長梭形或旋渦狀排列(圖1)。向成骨方向誘導(dǎo)后,細胞逐漸變圓,排列緊密,部分細胞重疊(圖2)。
將誘導(dǎo)后的BMSCs接種到溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿中,7~10 d后可見細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部,細胞排列緊密,部分區(qū)域可見細胞層疊現(xiàn)象。將培養(yǎng)皿放置20 ℃環(huán)境中60 min,可見貼壁細胞從培養(yǎng)皿邊緣處開始脫離,逐漸收縮,最終整個從培養(yǎng)皿底部脫離形成完整的細胞片層(圖3)。
圖1 原代培養(yǎng)的BMSCs呈長梭形或旋渦狀排列 HE×100Fig 1 The primary cultured BMSCs were arranged in fusiform or swirling HE×100
圖2 成骨誘導(dǎo)后的BMSCs細胞逐漸變圓,排列緊密HE×100Fig 2 BMSCs were changed to oblong and tightly arranged after differentiated into osteoblasts HE×100
圖3 細胞片層與培養(yǎng)皿底部分離,懸浮于培養(yǎng)液中Fig 3 The cell sheet completely separated from the petri dish and floated in the culture solution
電鏡下觀察PLGA支架呈多孔網(wǎng)狀三維立體結(jié)構(gòu),孔徑為100~300 μm。BMSCs植入及細胞片層包裹支架后3 d,可見細胞伸出多個偽足黏附在支架材料表面及孔隙中(圖4)。細胞片層及分泌的細胞外基質(zhì)覆蓋于支架表面(圖5)。
16只犬全部成活并進入結(jié)果分析。術(shù)后4周,支架材料被軟組織包繞,可見明顯支架結(jié)構(gòu),支架與周圍骨斷端分界明顯,觸之較軟。實驗側(cè)與對照側(cè)差別不明顯。術(shù)后8周,雙側(cè)仍可見部分支架輪廓,骨斷端與支架結(jié)合緊密,分界不清,支架下方有少量吸收,實驗側(cè)支架吸收量少于對照側(cè)。術(shù)后12周,實驗側(cè)骨缺損大部分被新生骨組織修復(fù),新生骨與正常下頜骨組織之間呈骨性愈合,骨斷端處未見外骨痂;對照側(cè)下頜骨下緣處骨缺損大于實驗側(cè)。術(shù)后16周,實驗側(cè)骨缺損大部分被新生骨替代,舌側(cè)形成與正常骨相似的密質(zhì)骨,與正常骨斷端骨性愈合,硬度與周圍骨組織相似(圖6上);對照側(cè)成骨量小于實驗側(cè),下頜骨下緣處仍可見骨缺損(圖6下)。
圖4 細胞在PLGA支架上附著生長良好 SEM×1 000Fig 4 Good cell adhesion and growth in the PLGA scaffold SEM×1 000
圖5 支架表面的BMSCs細胞片層結(jié)構(gòu) SEM×1 000Fig 5 Cell sheet microstructure on the surface of scaffold SEM×1 000
術(shù)后標本X線片光密度值見表1。由表1可見,實驗側(cè)與對照側(cè)標本X線片光密度值隨術(shù)后時間延長逐漸增加,不同時間點之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術(shù)后同一時間點實驗側(cè)光密度值大于對照側(cè),兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術(shù)后16周,實驗組光密度值最高,但仍低于周圍正常骨組織(0.677±0.095)。植入材料8~16周可見不規(guī)則的骨小梁影,隨時間增長,骨小梁增多、密集。骨斷端處可見高密度骨折線(圖7)。
圖6 術(shù)后16周,實驗側(cè)(上)和對照側(cè)(下)的大體觀察結(jié)果Fig 6 The general observation of experimental side(up)and control side(down)at 16 weeks post-operation
表1 術(shù)后標本X線片光密度值Tab 1 The optical density of X-ray imaging after operationn=4,±s
表1 術(shù)后標本X線片光密度值Tab 1 The optical density of X-ray imaging after operationn=4,±s
分組0.31 4周8周12周16周實驗側(cè) 9±0.001 0.362±0.020 0.378±0.009 0.616±0.044對照側(cè) 0.231±0.005 0.256±0.020 0.326±0.019 0.572±0.042
圖7 術(shù)后16周,實驗側(cè)(上)和對照側(cè)(下)的X線片觀察結(jié)果Fig 7 The X-ray imaging of experimental side(up)and control side(down)at 16 weeks post-operation
植入后4、8、12、16周,兩側(cè)的組織學觀察結(jié)果見圖8。術(shù)后4周,實驗側(cè)可見少量新生骨組織,骨小梁纖細,可見纖維性骨痂、多核巨細胞;骨斷端處纖維母細胞及新生血管較多。對照側(cè)新生骨較實驗側(cè)少,骨小梁纖細,不規(guī)則,可見肉芽組織。
圖8 植入后4、8、12、16周,實驗側(cè)和對照側(cè)的組織學觀察結(jié)果 HEFig 8 Histology observation of experimental side and control side at 4,8,12,16 weeks post-operation HE
術(shù)后8周,實驗側(cè)新生骨組織增多,骨小梁增粗,成骨活躍;髓腔周圍見多個骨母細胞;骨斷端處骨小梁排列紊亂,可見類骨質(zhì)。對照側(cè)成骨較實驗側(cè)少,骨小梁較細。術(shù)后12周,實驗側(cè)骨小梁較粗,增多,排列不規(guī)則,可見紅骨髓,髓腔內(nèi)血管豐富,周圍骨母細胞多。對照側(cè)骨小梁增多,較細,骨母細胞較實驗側(cè)少,血管較豐富。術(shù)后16周,實驗側(cè)骨小梁粗大,哈弗氏小管較豐富,周圍有同心圓排列的板層樣骨,骨細胞多且狀態(tài)良好,可見紅骨髓。骨髓腔中血管豐富,有較多鈣鹽沉積。對照側(cè)骨小梁較粗,可見哈弗氏系統(tǒng),但較實驗側(cè)少。
BMSCs可以被誘導(dǎo)分化成多種細胞,如成骨細胞、脂肪細胞等。由于具有這一特性,間充質(zhì)干細胞已經(jīng)被應(yīng)用在很多領(lǐng)域與實驗中。BMSCs只有經(jīng)過特定的誘導(dǎo)分化,接受細胞因子的調(diào)控,合成適當?shù)募毎饣|(zhì),才能修復(fù)病損或缺失的組織和器官,并使其具有一定的生物功能和組織結(jié)構(gòu)。用BMSCs構(gòu)建組織工程骨有必不可少的三要素:向成骨方向誘導(dǎo)分化的間充質(zhì)干細胞、具有引導(dǎo)成骨作用的支架材料、具有誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)骨形成作用的細胞因子[5]。
本實驗將犬BMSCs經(jīng)成骨方向誘導(dǎo)后植入多孔的可降解的支架材料中,并在支架表面包被BMSCs細胞片層。細胞片層技術(shù)是收獲種子細胞的一種方法,可以對組織工程細胞零傷害,非蛋白酶消化,溫度誘導(dǎo)性收獲。溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿底部為聚異丙基丙烯酰胺水凝膠用電輻射方法結(jié)合到聚苯乙烯培養(yǎng)皿中制作而成的。聚異丙基丙烯酰胺水凝膠為溫度反應(yīng)性材料,用此培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞7~10 d,待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部后,將溫度從37 ℃降到20 ℃,細胞與培養(yǎng)皿底部化合物之間形成一層水化膜,細胞與細胞之間連接得到保留,細胞完整地與培養(yǎng)皿分離形成細胞片層[6]。避免了使用胰酶分離貼壁細胞對細胞的傷害。貼壁的細胞連同細胞下層ECM一同釋放出來。被完整保留的細胞下層ECM確保收獲的連續(xù)細胞具有完整的細胞極性,細胞-細胞連接、細胞層-細胞層間立體連接以及細胞層與移植點之間的連接。獲取細胞片層并非利用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿一種方法,Nakamura等[7]曾使用細胞刮刀利用普通細胞培養(yǎng)皿成功獲取了細胞片層,但這種細胞片層分離方式為利用細胞刮刀機械性的刮取,需要的技術(shù)性很高,較容易造成細胞損傷。由于細胞片層的諸多優(yōu)勢,現(xiàn)在已經(jīng)被應(yīng)用于多種研究中,Sekine等[8]成功用細胞片層技術(shù)構(gòu)建出具有一定功能的管狀心肌結(jié)構(gòu)。Nishida等[9]利用自體口腔黏膜上皮細胞片層重建角膜組織。Zhou等[10]應(yīng)用細胞片層技術(shù)構(gòu)建出類似于正常骨結(jié)構(gòu)的新生骨組織。本實驗BMSCs片層中細胞排列致密,類似自然骨質(zhì)形成過程中成骨細胞的排列形態(tài)。將成骨細胞組成的細胞片層包裹到多孔支架表面,隨著成骨細胞不斷的合成分泌骨基質(zhì),以及鈣鹽的沉積和礦化,形成了由多層同心性板層骨圍繞中心哈弗氏小管和哈弗氏系統(tǒng)。
多孔支架材料需要提供給BMSCs一個暫時性的黏附并分泌基質(zhì)的環(huán)境,所以它應(yīng)具有一定的支持結(jié)構(gòu),能供細胞順利長入的空隙。它還應(yīng)具備一定的生物相容性和生物可降解性,一定的機械強度和可塑性[11]。本實驗所采用的PLGA支架材料具有良好的生物相容性,可應(yīng)用于臨床植入。PLGA呈多孔的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),空隙大小最有利于細胞和血管的生長,孔隙率為85%,利于成骨細胞的生長。相對分子質(zhì)量為100 000,能夠保證支架的降解速率和新生骨的生成速率基本一致。本實驗將支架修整成上寬下窄的形狀,并在背側(cè)修出一個凹槽來容納下頜神經(jīng)血管束,使下牙槽動脈穿過支架內(nèi)部,既保證了支架復(fù)合體的穩(wěn)定,又為大塊組織工程骨血供系統(tǒng)的構(gòu)建創(chuàng)造了條件。
rhBMP-2是一種具有較強誘導(dǎo)成骨作用的生長因子,它可以單獨誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨細胞方向分化,是骨形成過程中最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。VEGF是最有效的促血管生長因子,它能夠刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖和生長,促進血管的發(fā)生和血管的通透性。rhBMP-2不僅具有骨誘導(dǎo)活性,還能上調(diào)細胞中VEGF的表達。本實驗在4~16周的標本中血管都比較豐富。應(yīng)用rhBMP-2和VEGF能夠有利于形成具有豐富血管支持的大塊組織工程骨。
本實驗應(yīng)用犬BMSCs細胞片層包裹含有rhBMP-2、VEGF生長因子的PLGA支架,成功構(gòu)建組織工程骨,修復(fù)下頜骨缺損。新生的組織工程骨既有骨小梁和紅骨髓組成的松質(zhì)骨成分,也有哈弗氏系統(tǒng)板層骨等密質(zhì)骨成分,血管豐富,具有良好的硬度,為大塊頜骨缺損的修復(fù)提供了新思路。但組織工程骨的構(gòu)建仍存在諸多問題,如細胞片層技術(shù)在獲取種子細胞時較困難,細胞片層覆蓋支架表面不能深入內(nèi)部發(fā)揮作用等尚待深入研究與解決。
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