荔枝皮中原花青素提取工藝優(yōu)化及其黃烷－3－醇HPLC分析

劉 新 余小平 游江舟 婁 彬

（成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川 成都 610083）

荔枝（litchi chinensis），無(wú)患子科（sapindaceae）荔枝屬（litchi）。其皮中黃烷－3－醇類活性物質(zhì)含量較高，原花青素、表兒茶素和沒食子酸是其主要成份［1，2］。

黃烷醇類化合物是一類廣泛存在于天然植物中的多元酚化合物，其獨(dú)特的酚羥基結(jié)構(gòu)使其具有清除烷氧自由基和超 氧 離 子 自 由 基 的 能 力，其 中 的 原 花 青 素（proanthocyanidins）成份是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成的低聚體和多聚體，具備較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力，在預(yù)防及治療心血管疾病、抗癌、抗過(guò)敏、抗突變、抗衰老等方面作用顯著［3，4］。鐵鹽催化比色法對(duì)原花青素多聚體測(cè)定專一性較好，為普遍應(yīng)用的檢測(cè)方法［5，6］。但是黃烷－3－醇兒茶素類成份，沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（－C）、表兒茶素（EC）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）在鐵鹽催化比色法中不顯色，故不能完全反映荔枝皮中生物活性成份，尤其是表兒茶素物質(zhì)［2，7，8］。目前對(duì)荔枝皮中EGC和ECG 含量的檢測(cè)還未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)采用超聲破碎機(jī)對(duì)荔枝皮細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，使其中的活性物質(zhì)直接溶于提取溶液中。采用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化荔枝皮中原花青素超聲波輔助提取工藝參數(shù)，并在最佳工藝參數(shù)下對(duì)荔枝皮中黃烷－3－醇類成份進(jìn)行提取，使用鐵鹽催化比色法和HPLC 法對(duì)其黃烷－3－醇類成份及含量進(jìn)行分析，以期最大程度反映荔枝皮中黃烷－3－醇類抗氧化活性成分并為其有效開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

荔枝：品種妃子笑，購(gòu)于成都超市。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（PA）：純度≥98%，葡萄籽提取物，天津尖峰天然產(chǎn)物開發(fā)公司；

沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（－C）、表兒茶素（EC）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）化學(xué)對(duì)照品：HPLC≥98%，色譜純，成都瑞芬思生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，F(xiàn)isher Scientific，USA；

石油醚（沸程30～60 ℃）、無(wú)水甲醇、硫酸鐵銨、鹽酸、正丁醇和冰乙酸：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 主要儀器

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JY92－IIN，20～25kHz頻率自動(dòng)跟蹤，6Φ 變幅桿，寧波新芝生物科技股份有限公司；

冷凍干燥機(jī)：ZKES，Virtis USA；

日立 高 效 液 相 色 譜：UV Detector：L－2400，pump：L－2130，日本株式會(huì)社日本高新技術(shù)那珂事業(yè)所；

紫外－可見光分光光度計(jì)：UV－1102，天美科技有限公司；

電子天平：BSA124S，北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司；

索氏提取器：SZF－06，上海華睿儀器有限公司；

超聲波清洗機(jī)：SB25－12DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 荔枝皮預(yù)處理 新鮮荔枝去皮，40 ℃干燥、粉碎、過(guò)篩、石油醚脫脂、陰干、4 ℃避光，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 提取流程 準(zhǔn)確稱取0.3g荔枝皮粉，以純水為提取劑，在（78±2）℃、pH 7.0條件下，對(duì)荔枝皮中原花青素及黃烷－3－醇兒茶素類活性物質(zhì)進(jìn)行超聲波破碎提取，提取液在5 000r／min條件下離心、0.45μm 過(guò)濾、于－50℃冷凍干燥。凍干提取物加不同體積分?jǐn)?shù)甲醇并超聲溶解，再吸取1mL提取物采用鐵鹽催化比色法和高效液相色譜法，對(duì)荔枝皮中黃烷－3－醇類成份及含量進(jìn)行分析定量。由于原花青素為聚合體，其單元間的連接鍵易在酸性作用下被打開。下部單元生成黃烷－3－醇兒茶素成份，上部單元生成花色素［6］。故在對(duì)荔枝皮中原花青素提取時(shí)pH 值定在7.0，以客觀的體現(xiàn)荔枝皮中黃烷－3－醇兒茶素成份含量。

1.3.3 荔枝皮中原花青素提取工藝參數(shù)的優(yōu)化 通過(guò)Box－Behnken Design試驗(yàn)構(gòu)建多元回歸模型，使用Design－Expert 8.0.6軟件優(yōu)化功能優(yōu)化得出荔枝皮中原花青素超聲波輔助提取工藝參數(shù)組合。通過(guò)前期預(yù)試驗(yàn)得出BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)考察因素和水平編碼見表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels

1.3.4 荔枝皮中黃烷－3－醇類成份含量確證 以荔枝皮為原料，在最佳工藝參數(shù)組合下，提取1次，用鐵鹽催化比色法和HPLC法對(duì)其黃烷－3－醇類成份及含量進(jìn)行研究，并確定最佳甲醇體積分?jǐn)?shù)。

1.3.5 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程建立 按鐵鹽催化比色法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線［5］，回歸方程為y ＝0.0024x＋0.027 2，R2＝0.996（y 表示吸光度，x 表示原花青素含量），其濃度在30～250μg／mL呈良好的線性關(guān)系［9］。

1.3.6 HPLC 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程建立 色譜條件：色譜柱為反相Allsphere ODS－25u柱（4.6 mm×250 mm，5μm）。流動(dòng)相A 為0.2%的乙酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇。流動(dòng)相洗脫梯度：0～15min流動(dòng)相B（甲醇），從10%增加到60%；15～22.5min流動(dòng)相B保持在60%；22.5～25min流動(dòng)相B從60%回到10%；25～30min，流動(dòng)相B 保持在10%。流速為0.5 mL／min，柱溫：室溫，檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，分析周期30 min，進(jìn)樣量10μL［10］。

分別精確稱取GA、－C、EC 和ECG 標(biāo)準(zhǔn)品20.00mg，用無(wú)水甲醇溶解、定容至10mL，制得濃度為2.00mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。稱取EGC標(biāo)準(zhǔn)品20.00mg，用無(wú)水甲醇溶解、定容至1mL，制得濃度為20.00mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。稀釋配置成5 個(gè)不同梯度的混合液。混合液中EGC 濃度梯度為62.5，125，250，500，1 000μg／mL；其余標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度為25，50，100，200，400μg／mL。在上述色譜條件下進(jìn)樣量10μL，得到進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品濃度（W）與對(duì)應(yīng)峰面積（A）方程，見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 The curvilinear equations and R

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝皮中原花青素提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 Box－Behnken Design試驗(yàn)組合及結(jié)果 用Design－Expert 8.0軟件隨機(jī)產(chǎn)生BBD 試驗(yàn)方案，以吸光度值為評(píng)價(jià)指標(biāo)（吸光度值與荔枝皮中原花青素超聲提取量呈正比關(guān)系）。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box－Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box－Behnken Design and response absorbance values for the proanthocyanidins

2.1.2 顯著性檢驗(yàn)和回歸模型建立 BBD 試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表4。回歸模型F 檢驗(yàn)極顯著（P＜0.000 1），僅有0.01%的概率發(fā)生偏差。回歸模型調(diào)整后的回歸決定系數(shù)R2值為0.899 1，信噪比為17.263，失擬項(xiàng)F ＝0.7，表示模型失擬不顯著，擬和度良好，說(shuō)明該模型可以用來(lái)評(píng)估該試驗(yàn)考察因素設(shè)計(jì)［11，12］?？疾煲蛩胤讲罘治鼋Y(jié)果顯示：A、B、C、A2、C2、AB、AC和BC 對(duì)荔枝皮中原花青素提取的影響顯著性（P ＜0.05）；D、B2、D2、AD、BD 和CD 對(duì)其中原花青素提取的影響不顯著（P＞0.05）。

表4 方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 4 Variance analysis and significance tests

將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸建模，得到荔枝皮中原花青素吸光度值與各考察因素的四元二次回歸方程為：

由于方程經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理，可直接由考察因素二次項(xiàng)系數(shù)來(lái)確定影響荔枝皮中原花青素超聲波輔助提取因素大小順序，即：荔枝皮粉碎度＞超聲提取時(shí)間＞超聲波功率＞料液比。

2.1.3 考察因素等高線圖分析 由圖1～4可知，在諸因素中，粉碎度目數(shù)起最顯著影響作用，等高線陡峭，說(shuō)明控制好該因素是提高超聲波輔助提取原花青素的關(guān)鍵因素；超聲時(shí)間對(duì)原花青素提取亦為顯著影響作用，提取過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制時(shí)間。因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的超聲波熱效應(yīng)會(huì)使溶出的原花青素遇熱分解［13］，試驗(yàn)顯示用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)來(lái)提取荔枝皮中原花青素時(shí)，在超聲波為200 W 時(shí)，提取液溫度在5 min左右到達(dá)（78±2）℃，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)一直保持在（78±2）℃；料液比和超聲功率對(duì)原花青素吸光度值影響最小，等高線偏向平直。說(shuō)明超聲功率在試驗(yàn)取值范圍內(nèi)對(duì)原花青素提取量影響不大，可以把超聲波功率值設(shè)定在偏低范圍。如果使超聲波功率繼續(xù)加強(qiáng)，超聲波的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)會(huì)對(duì)原花青素的分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用［14］，導(dǎo)致原花青素提取量降低。

圖1 粉碎度與超聲時(shí)間對(duì)原花青素吸光度值的交互影響Figure 1 The interactive effects of particle size and ultrasonic duration on the absorbance value of proanthocyanidins

圖2 料液比與超聲時(shí)間對(duì)原花青素吸光度值的交互影響Figure 2 The interactive effects of liquid－solid ratio and ultrasonic duration on the absorbance value of proanthocyanidins

圖3 粉碎度與料液比對(duì)原花青素吸光度值的交互影響Figure 3 The interactive effects of particle size and liquid－solid ratio on the absorbance value of proanthocyanidins

圖4 粉碎度與超聲波功率對(duì)原花青素吸光度值的交互影響Figure 4 The interactive effects of particle size and ultrasonic power on the absorbance value of proanthocyanidins

通過(guò)Design－Expert 8.0.6軟件優(yōu)化功能進(jìn)行優(yōu)化，以理想最大荔枝皮中超聲波輔助提取原花青素提取量（吸光度預(yù)測(cè)值2.190Abs）為目標(biāo)，得出最佳提取工藝參數(shù)組合，即：荔枝皮粉碎度71.91目、料液比1∶29.97（m∶V）、超聲時(shí)間21.75min和超聲波功率390.48 W（見圖5）。

圖5 粉碎度、料液比、超聲時(shí)間和超聲波功率最佳工藝參數(shù)Figure 5 Optimal conditions of the prediction of the effects of the four factors on the proanthocyanidins absorbance values

2.1.4 確證最佳提取工藝參數(shù) 考慮到實(shí)際情況，把最佳提取工藝參數(shù)做了細(xì)微調(diào)整。稱取0.3g脫脂、過(guò)80目標(biāo)準(zhǔn)篩荔枝核粉碎粉末3份。按料液比為1∶30（m∶V）、超聲波功率為400 W、超時(shí)時(shí)間為22min，提取1次，取離心過(guò)濾提取液1mL在－50 ℃下凍干，用無(wú)水甲醇超聲復(fù)溶，荔枝皮中原花青素吸光度平均值為2.157Abs，為響應(yīng)面法得出原花青素吸光度預(yù)測(cè)值的98.50%，表明了該試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的合理性和有效性。

2.2 黃烷－3－醇類成份最佳甲醇溶解體積分?jǐn)?shù)及各成份含量分析

在最佳提取工藝參數(shù)下對(duì)荔枝皮超聲破碎提取1次，離心、過(guò)濾、取上清液1mL，－50 ℃下凍干。向凍干的提取物中加入1mL 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%甲醇并超聲溶解，溶解液過(guò)0.45μm 微孔濾膜，取濾液在給定色譜檢測(cè)條件下進(jìn)樣3次，比較不同體積分?jǐn)?shù)甲醇對(duì)荔枝皮中黃烷－3－醇類成份溶出含量的影響程度，確定各成份的最佳甲醇體積分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表5。

表5 荔枝皮中不同甲醇體積分?jǐn)?shù)黃烷－3－醇類成份含量Table 5 The contents of flavan－3－ol under different methanol fraction from litchi pericarp／（mg·g1）

由表5可知，荔枝皮中黃烷－3－醇類各成份隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加，尤其是EGC、EC、ECG 和－C呈顯著增加趨勢(shì)。甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，GA 的含量最高；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，EGC、－C和ECG 的含量最高；而EC和PA在甲醇體積為80%時(shí)含量最高。EGC 成份在荔枝皮中含量較高，占HPLC法分離組份成份的15.5%。

3 討論與結(jié)論

在用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)對(duì)荔枝皮中活性物質(zhì)進(jìn)行提取時(shí)，使用純水作為提取溶劑，避免不同極性溶劑對(duì)荔枝皮中的黃烷－3－醇類成份提取的影響，客觀反映超聲波細(xì)胞破碎機(jī)參數(shù)對(duì)荔枝皮中活性物質(zhì)提取的作用。

由于原花青素按聚合度分為很多種類，且原花青素的檢測(cè)方法在國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)不一。目前用高效液相色譜法來(lái)確定物質(zhì)中原花青素的含量用的是原花青素B1、原花青素B2。但正丁醇鐵鹽比色法用的是葡萄籽原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%（分光光度法檢測(cè)），此方法在中文文獻(xiàn)中采用較為普遍。故在試驗(yàn)中原花青素檢測(cè)這一部分用的是葡萄籽原花青素標(biāo)準(zhǔn)品。

采用Box－Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)超聲波輔助水提荔枝皮中原花青素的影響因素進(jìn)行考察并構(gòu)建模型，得出考察因素最佳提取工藝參數(shù)組合，即：荔枝皮粉碎度71.91目、料液比1∶29.97（m∶V）、超聲時(shí)間21.75min和超聲波功率390.48 W，通過(guò)確證實(shí)驗(yàn)證明了最佳提取工藝參數(shù)組合的有效性。在最佳超聲波輔助水提工藝參數(shù)下對(duì)荔枝皮進(jìn)行超聲破碎提取1次，離心、過(guò)濾、取上清液1mL 在－50 ℃溫度下凍干，用1mL不同體積分?jǐn)?shù)甲醇進(jìn)行超聲復(fù)溶，并通過(guò)鐵鹽催化比色法、HPLC法分析得出最佳的荔枝皮黃烷－3－醇類成份含量：PA 為89.32 mg／g、GA 為1.11 mg／g、EGC為87.09mg／g、－C為3.37mg／g、EC為31.15mg／g和ECG為7.02mg／g。

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