鰱魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)分析與回收

許艷順 高 琪 姜啟興 夏文水

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

在魚制品加工中，魚糜制品因其高蛋白、低脂肪、口感嫩爽等特點(diǎn)已成為深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者歡迎的水產(chǎn)加工大類產(chǎn)品，在中國(guó)已形成一定的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模，并且發(fā)展迅速，產(chǎn)量和消費(fèi)量逐年增加。在魚糜生產(chǎn)過(guò)程中，魚肉必須經(jīng)過(guò)多次漂洗以除去部分阻礙魚糜凝膠形成和影響魚糜感官品質(zhì)的酶類、脂肪、色素、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)，同時(shí)引起大量蛋白質(zhì)主要是水溶性蛋白質(zhì)的損失，導(dǎo)致魚糜得率降低［1］。漂洗廢水中一般含有0.5%～2.3%的蛋白質(zhì)，直接排放不僅污染環(huán)境，同時(shí)還造成蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)［2］。因此，對(duì)魚糜漂洗廢水中蛋白質(zhì)進(jìn)行回收利用，可以降低魚糜漂洗廢水對(duì)環(huán)境的污染，同時(shí)可以提高資源利用率和企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

近年來(lái)，對(duì)魚糜漂洗廢水中蛋白質(zhì)的回收利用已引起國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。目前魚糜漂洗廢水中蛋白回收方法主要有膜分離法［3］、絮凝法［4，5］、調(diào)節(jié)pH 值法［1，6］、電阻加熱法［7］等。膜分離法回收效果較好，但易導(dǎo)致膜污染；電阻加熱法耗能大，回收成本較高［8］。褐藻膠作為天然有機(jī)高分子絮凝劑對(duì)廢水中蛋白質(zhì)具有較好的絮凝效果，且回收蛋白可回添至魚糜中［9，10］。蛋白質(zhì)是帶有正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)的兩性電解質(zhì)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近較低的溶解性來(lái)沉淀回收漂洗液中蛋白質(zhì)，操作簡(jiǎn)單，成本低廉［1］。

本試驗(yàn)對(duì)鰱魚糜不同漂洗階段的漂洗液中蛋白含量和組成進(jìn)行分析，并進(jìn)一步采用調(diào)節(jié)魚糜漂洗液pH 法和海藻膠絮凝法對(duì)漂洗液中蛋白質(zhì)進(jìn)行回收和分析，旨在為淡水魚糜加工過(guò)程中漂洗廢水的回收處理提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鰱魚：鮮活，體重2～3kg／條，購(gòu)于無(wú)錫某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；

四甲基乙二胺（TEMED）：純度≥99%，美國(guó)Sigma公司；

丙烯酰胺、N，N”－亞甲基雙丙烯酰胺：

純度＞98%，瑞士Fluka Biochemica公司；

β－巰基乙醇：純度98%，美國(guó)Amresco公司；

蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：寶生物工程（大連）有限公司；

其它試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)：4K－15型，德國(guó)Sigma公司；

紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV－1000型，上海天美科學(xué)儀器有限公司；

pH 計(jì)：320－s型，梅特勒－托利多儀器上海有限公司；

多功能食品加工機(jī)：SQ2119DX 型，上海帥佳電子科技有限公司；

電泳儀：DYY－8C型，北京市六一儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 魚糜漂洗液制備 將新鮮鰱魚去頭、內(nèi)臟，清水沖洗干凈后，采肉機(jī)采肉。漂洗時(shí)控制魚肉與水的比例為1∶4（m∶V），先慢速攪拌6min，再靜置10min，之后用4層紗布過(guò)濾，得到漂洗液置于4 ℃冰箱中備用（冷藏時(shí)間不超過(guò)24h）。在漂洗過(guò)程中應(yīng)控制溫度不超過(guò)10 ℃。用清水漂洗兩次后，第3次漂洗采用0.3% （m∶V）鹽水漂洗。所得到的3次漂洗液依次記為WS－Ⅰ，WS－Ⅱ和WS－Ⅲ。

1.2.2 調(diào)節(jié)pH 法回收漂洗液蛋白質(zhì) 分別取30mL 魚糜漂洗液于100 mL 燒杯中，用1 mol／L HCl調(diào)節(jié)漂洗液pH至pH 3.0～6.0（以0.5為梯度），漂洗液用蒸餾水分別補(bǔ)至40mL，然后在設(shè)定溫度條件下（4，21，30 ℃）靜置30min后4 000r／min離心10min，測(cè)定上清液的體積和蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算蛋白質(zhì)回收率。

1.2.3 褐藻膠絮凝法回收漂洗液蛋白質(zhì) 分別取30mL魚糜漂洗液于100mL錐形瓶中，用1mol／L HCl調(diào)節(jié)漂洗液pH 至3.0～6.0（以0.5為梯度），漂洗液用蒸餾水分別補(bǔ)至40mL，然后按100mg／L 添加1%褐藻膠溶液，錐形瓶用保鮮膜封口，放入搖床中，搖床參數(shù)設(shè)置為20 ℃，120r／min，5min后取出靜置30min，4 000r／min離心10min，收集上清液，測(cè)定上清液的體積和蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算蛋白質(zhì)回收率。

1.3 分析方法

1.3.1 pH 的測(cè)定 采用pH 計(jì)直接測(cè)定。

1.3.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 采用雙縮尿法。

1.3.3 蛋白質(zhì)回收率計(jì)算 按式（1）計(jì)算：

1.3.4 SDS－PAGE 電泳 采用Laemmli法。將電泳蛋白樣品與等體積的SDS－PAGE 樣品處理液（0.125 mol／L pH 6.8Tris－HCl緩沖液，4%SDS，20%甘油，10%β－巰基乙醇，0.005% 溴酚藍(lán)）混合，沸水加熱5min后，采用4%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行SDS－PAGE 電泳。起始電泳電壓為80V，待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V。電泳完成后，采用考馬斯亮藍(lán)R250染色，用醋酸甲醇溶液進(jìn)行脫色。

蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物：肌球蛋白（200kDa），β－半乳糖苷 酶（116 kDa），磷 酸 酶b（97.2 kDa），牛 血 清 蛋 白（66.4kDa），卵清蛋白（44.3kDa），磷酸苷酶（29.0kDa），胰蛋白酶抑制劑（20.1kDa），溶菌酶（14.3kDa）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。所有數(shù)據(jù)采用Excel作圖，采用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 魚糜漂洗液中蛋白含量和組成分析

由圖1可知，魚糜漂洗液中含有大量的蛋白質(zhì)，3次漂洗液中蛋白質(zhì)濃度分別為WS－Ⅰ（12.37±0.09）mg／mL，WS－Ⅱ（3.12±0.09）mg／mL，WS－Ⅲ（1.75±0.07）mg／mL，隨著漂洗次數(shù)的增加，漂洗液中蛋白含量逐漸減少。由圖2 可知，漂洗液WS－Ⅰ中蛋白質(zhì)分子量分布在20.1～97.2kDa，其中主要蛋白組分集中在44.3kDa左右。漂洗液WS－Ⅱ和WS－Ⅲ中的蛋白質(zhì)分子量也大部分處于29.0～66.4kDa，但含量比WS－Ⅰ顯著減少。因此，在蛋白回收研究中采用漂洗液WS－Ⅰ。

2.2 pH 值和溫度對(duì)蛋白回收效果的影響

圖1 不同漂洗階段漂洗廢水中蛋白質(zhì)含量Figure 1 Protein concentration in surimi washwater at different wash stages

圖2 漂洗廢水中蛋白質(zhì)SDS－PAGE電泳圖Figure 2 SDS－PAGE patterns of proteins in surimi wash－water at different stages

蛋白質(zhì)是帶有正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)的兩性電解質(zhì)，pH值能夠改變氨基酸殘基側(cè)鏈的電荷分布和蛋白分子帶電基團(tuán)的電荷數(shù)量。當(dāng)環(huán)境pH 值偏離等電點(diǎn)越近，蛋白分子所帶的靜電荷越少，蛋白分子在等電點(diǎn)處所帶靜電荷為零，蛋白分子間的靜電斥力最小，蛋白分子趨于聚集沉淀。因此調(diào)節(jié)pH 值的變化能夠降低或增加蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而影響蛋白質(zhì)聚集沉淀。

不同pH 和溫度條件下魚糜漂洗液中蛋白回收效果見(jiàn)圖3。由圖3可知，在3個(gè)處理溫度條件下，隨著魚糜漂洗液pH 的降低，蛋白回收率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在pH 5.0處蛋白回收率均達(dá)到最大，在4，21，30℃3個(gè)不同處理溫度條件下蛋白質(zhì)最大回收率分別為42.73%，47.40%和54.81%。Bourtoom 等［1］通過(guò)調(diào)節(jié)pH 值對(duì)金線魚（threadfin bream）魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的回收研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白回收率隨pH 的下降而下降，在pH 3.5除蛋白回收率最大，為66.3%。Chen等［11］通過(guò)等點(diǎn)聚焦電泳（IEF）研究發(fā)現(xiàn)魚肉水溶性蛋白組分的等電點(diǎn)在3.5～5.2，5.85～6.55 和7.35～8.15處。溫度對(duì)蛋白回收效果有顯著影響，在選擇的3個(gè)處理溫度條件下，蛋白回收率隨著溫度的增加而逐漸增加，這與Bourtoom 等的研究報(bào)道［1］一致。

圖3 不同pH、溫度對(duì)蛋白質(zhì)回收效果的影響Figure 3 Effect of pH and temperature on recovery of proteins in surimi wash water

由圖4可知，不同溫度條件下所得上清液中蛋白質(zhì)電泳圖譜相似，表明處理溫度對(duì)回收蛋白質(zhì)組成影響不大。但不同pH 條件下上清液中蛋白電泳圖譜條帶顯著不同，隨著pH 的降低，較高分子量蛋白條帶，尤其是分子量在44.3kDa左右的蛋白質(zhì)電泳條帶逐漸變淡，而低分子量蛋白質(zhì)（14.3～20.1kDa）的電泳條帶強(qiáng)度逐漸增加，表明隨著pH的降低，較高分子量蛋白質(zhì)部分水解為低分子量蛋白質(zhì)，而且當(dāng)pH 值低于5.0 時(shí)，蛋白降解愈加明顯。由電泳圖譜（圖4）可知，當(dāng)pH 小于5.0時(shí)蛋白回收率逐漸下降可能是由于在較低pH 條件下蛋白分子降解為低分子量的多肽，蛋白溶解性增加，導(dǎo)致沉淀回收的蛋白質(zhì)量減少。

2.3 pH 值對(duì)褐藻膠絮凝回收蛋白效果的影響

圖4 不同pH、溫度對(duì)離心上清液中蛋白質(zhì)SDS－PAGE圖譜的影響Figure 4 Effect of pH and temperature on SDS－PAGE patterns of protein in supernatant

圖5 pH 對(duì)褐藻膠絮凝回收漂洗液中蛋白質(zhì)效果的影響Figure 5 Effect of pH on protien recovery from surimi wash water using alginate

褐藻膠作為絮凝劑已廣泛用于食品加工廢水處理中。由圖5可知，pH 對(duì)褐藻膠絮凝回收蛋白效果影響顯著，且褐藻膠絮凝回收率隨pH 的變化與單獨(dú)調(diào)節(jié)pH 的蛋白回收率變化趨勢(shì)一致。隨著pH 的降低褐藻膠絮凝回收率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在pH 5.0時(shí)蛋白回收效果最好，蛋白回收率回收率達(dá)到70.25%。海藻膠絮凝法與調(diào)節(jié)pH 法相比，當(dāng)pH 小于3.5時(shí)，海藻膠絮凝法回收蛋白質(zhì)沒(méi)有優(yōu)勢(shì)；當(dāng)pH 大于3.5時(shí)，在相同pH 條件下海藻膠絮凝法的蛋白回收率較單獨(dú)調(diào)節(jié)pH 法顯著提高，在pH 5.0時(shí)褐藻膠絮凝回收率比單獨(dú)調(diào)節(jié)pH 的空白組回收率（47.40%）高出22%。結(jié)果表明，褐藻膠絮凝法結(jié)合調(diào)節(jié)pH 法可顯著提高漂洗廢水中蛋白質(zhì)的回收效果。張宗恩等［10］研究發(fā)現(xiàn)，褐藻膠回收魚糜漂洗液中的蛋白質(zhì)在pH 3.78～4.92范圍內(nèi)具有較好的回收效果。

3 結(jié)論

（1）鰱魚糜漂洗液中含有大量較低分子量的水溶性蛋白質(zhì)組分，且蛋白質(zhì)主要集中在第1次漂洗液中，生產(chǎn)過(guò)程中需重點(diǎn)對(duì)第1次漂洗液中蛋白質(zhì)進(jìn)行回收利用。

（2）通過(guò)調(diào)節(jié)魚糜漂洗液pH 值和控制適當(dāng)?shù)奶幚頊囟瓤捎行Щ厥掌匆褐械牡鞍踪|(zhì)。該方法操作簡(jiǎn)單，但單獨(dú)調(diào)節(jié)pH 法的蛋白回收率不是很高，調(diào)節(jié)pH 法結(jié)合褐藻膠絮凝法可顯著提高漂洗液中蛋白質(zhì)的回收效果。

（3）本試驗(yàn)雖比較了不同方法對(duì)魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的回收效果，但對(duì)于回收蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。

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