茶鮮葉酶促氧化合成茶黃素研究

龔志華 李 徐 朱盛堯 陳 朵 肖文軍，3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)系，湖南 長沙 410128；2.長沙和潤茶業(yè)科技有限公司，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源工程系，湖南 長沙 410128）

茶黃素是由茶多酚、兒茶素及其衍生物氧化縮合而來的，且溶于乙酸乙酯呈橙黃色的一類物質(zhì)，被譽(yù)為茶葉中的腦黃金［1］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定的茶黃素及其前導(dǎo)物共有15種，并一致認(rèn)為茶黃素（TF）、茶黃素－3 沒食子酸（TF－3－G）、茶黃素－3’－沒食子酸酯（TF－3’－G）和茶黃素雙沒食子酸酯（TFDG）是4種主要的茶黃素［2］。由于茶黃素在穩(wěn)定性以及抗過敏、防治心血管疾病等功能上遠(yuǎn)優(yōu)于兒茶素，使得高茶黃素制品的市場需求旺盛且供不應(yīng)求，這主要源于中國紅茶茶黃素含量較低（≤0.7%）以及通過提取分離紅茶茶黃素的方法來制備茶黃素等客觀原因［3－5］。為提高制備茶黃素的原料基質(zhì)的茶黃素含量，國內(nèi)外學(xué)者采用茶鮮葉勻漿模擬發(fā)酵法、其它植物多酚氧化酶酶促發(fā)酵法以及微生物酶促發(fā)酵法合成茶黃素［6－10］，但由于受到茶葉生產(chǎn)季節(jié)、多酚氧化同工酶的多樣性以及優(yōu)勢(shì)微生物菌種篩選的成功性小等原因的局限，酶促生物發(fā)酵制備茶黃素未能取得突破性進(jìn)展。試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，比較研究政和大白茶、秀紅、碧香早3種茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的效率，優(yōu)化篩選最優(yōu)茶鮮葉原料酶促合成茶黃素工藝技術(shù)參數(shù)，旨在為茶黃素的高效制備提供技術(shù)支持與數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

茶鮮葉原料：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)中對(duì)12種茶鮮葉酶促合成茶黃素的檢測(cè)結(jié)果，選擇湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長安教學(xué)實(shí)習(xí)基地春季大葉種－政和大白茶、中葉種－碧香早、小葉種－秀紅的一芽二葉茶鮮葉作為試驗(yàn)原料。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

1.2.1 試劑

鄰苯二酚、檸檬酸、冰乙酸、磷酸氫二鈉、石英砂：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙腈：色譜純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；

乙酸乙酯：色譜純，天津市津科精細(xì)化工研究所；

N，N－二甲基甲酰胺：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；

甲醇：色譜純，上海振興化工一廠。

1.2.2 儀器設(shè)備

電子天平：FAZ104S型，上海精科科學(xué)儀器有限公司；

組織搗碎勻漿機(jī)：FS－1（YQ－3）型，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：TDL5M 型，長沙英泰儀器有限公司；

大容量常溫離心機(jī)：DD5型，長沙英泰儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH 型，金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；

紫外分光光度計(jì)：UV－2100型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

高效液相色譜儀：LC10AT－VP Plus型，日本島津公司；

鼓風(fēng)干燥箱：DHG－9240A 型，上海一恒科技有限公司；

干燥機(jī)：XMY 型，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；

超聲波清洗機(jī)：KQ－100 型，昆山市超聲波儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)見圖1。

圖1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)圖Figure 1 The design of the test

1.3.2 方法

（1）酶促氧化反應(yīng)底物制備：稱取政和大白茶、碧香早、秀紅的茶鮮葉各2g，分別加入45mL預(yù)冷pH 4.8檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液，組織勻漿5 min后，立即沸水浴鈍化酶活3～4min。冷卻，轉(zhuǎn)入離心管，常溫下于4 000r／min離心15min，將離心后的上清液定容至100mL，檢測(cè)兒茶素含量，作為酶促反應(yīng)底物備用。

（2）酶液制備：稱取政和大白茶的茶鮮葉0.12g，加入少許緩沖溶液及石英砂研磨成漿，4℃下于4 000r／min冷凍離心15min，取上清液定容至15mL，放入4 ℃的冰箱，作為酶源備用。

（3）酶促氧化反應(yīng)：將以上制備好的反應(yīng)底物分別移入100mL三角瓶中，放入30 ℃的水浴鍋中預(yù)熱10min，然后用移液管移取5mL酶液于三角瓶中，搖勻，90min后沸水浴終止反應(yīng)，取10mL反應(yīng)液檢測(cè)兒茶素和茶黃素含量。

（4）酶促氧化合成茶黃素的最優(yōu)茶鮮葉原料篩選：以春季政和大白一芽二葉茶鮮葉勻漿液為酶源，以單位質(zhì)量茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的量為考察指標(biāo)，比較研究政和大白茶、秀紅、碧香早3種茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的效率以及各原料在酶促反應(yīng)前后的兒茶素變化，篩選酶促氧化合成茶黃素的最優(yōu)茶鮮葉原料。

（5）最優(yōu)茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的單因素試驗(yàn)：以春季政和大白一芽二葉茶鮮葉勻漿液為酶源，以單位質(zhì)量最優(yōu)茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的量為考察指標(biāo)，依次研究酶促反應(yīng)體系pH 值、溫度、時(shí)間、酶源用量4個(gè)因子對(duì)合成茶黃素的影響；各因素的水平設(shè)置見表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平表Table 1 The level of single factor test

（6）最優(yōu)茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以單位質(zhì)量最優(yōu)茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的量為考察指標(biāo)，選擇影響顯著因素及其合理水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化最優(yōu)茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素的工藝技術(shù)參數(shù)。

（7）最優(yōu)正交組合的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)：對(duì)正交試驗(yàn)中所得的最優(yōu)組合進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。

1.3.3 檢測(cè)方法

（1）茶黃素檢測(cè)方法：參照文獻(xiàn)［11］。

（2）兒茶素檢測(cè)方法：參照文獻(xiàn)［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶促氧化合成茶黃素的最優(yōu)茶鮮葉原料篩選

不同品種茶鮮葉原料作為底物對(duì)合成茶黃素的影響見表2。由表2可知，茶黃素合成總量（TFs）以政和大白茶的最多，其次為碧香早、秀紅，同時(shí)，不同品種茶鮮葉合成茶黃素的各個(gè)單體含量存在差異。以碧香早為底物，合成的茶黃素中TF、TF－3－G占主導(dǎo)地位；而以政和大白、秀紅作為底物合成的茶黃素中，TF、TF－3－G、TFDG 合成量相當(dāng)，TF－3’－G相對(duì)較少。這與茶黃素合成的過程中實(shí)際消耗的兒茶素種類有關(guān)系。

表2 不同茶樹品種鮮葉原料對(duì)合成茶黃素的影響Table 2 Effect of fresh leaves of tea varieties on synthesizing theaflavins／（mg·g－1·Fresh Leaves）

由表3可知，政和大白茶鮮葉原料反應(yīng)后EGCG、EGC、EC、ECG 含量減少，而DL－C、GCG 的含量增加；秀紅茶鮮葉原料反應(yīng)后EGC、EC 也減少，其它兒茶素各單體均增加；碧香早茶鮮葉原料反應(yīng)后EGC、DL－C、EC、ECG 含量減少，GCG 增加。同時(shí)，單位質(zhì)量政和大白茶和秀紅鮮葉的EGCG、ECG、EGC、EC 含量顯著高于碧香早。因此，EGCG、ECG、EC含量較高的茶鮮葉品種原料有利于合成茶黃素。這主要是由于茶黃素類化合物是由成對(duì)的兒茶素經(jīng)過多酚氧化酶催化形成鄰醌，B環(huán)上有2個(gè)鄰位羥基的簡單兒茶素（L－EC，L－EGC）與B 環(huán)上有3個(gè)鄰位羥基的沒食子兒茶素（L－ECG 和L－EGCG）共同存在時(shí)，它們氧化后的鄰醌B環(huán)之間可縮和形成茶黃素［12］。因此，選擇政和大白茶鮮葉作為后續(xù)酶促氧化合成茶黃素的最優(yōu)茶鮮葉原料。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 酶促反應(yīng)體系pH 值對(duì)合成茶黃素的影響 由圖2

表3 不同茶樹品種鮮葉原料反應(yīng)前后兒茶素的變化Table 3 Change of catechins in reacting system of different tea fresh leaves／（mg·g－1·Fresh Leaves）

可知，隨著pH 的增加，茶黃素各個(gè)單體及其總量均呈現(xiàn)出先緩慢增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)pH 為5.0 時(shí)，各個(gè)單體及其總量均達(dá)到最大值。其中，TFDG 變化最為突出，大約減少了35.7%，其次為TF－3’－G。因此，pH 5.0是合成茶黃素的適宜pH 值。

圖2 酶促反應(yīng)體系pH 值對(duì)合成茶黃素的影響Figure 2 Effect of pH value in the reacting system on the systhsis of theaflavins

2.2.2 酶促反應(yīng)體系溫度對(duì)合成茶黃素的影響 由圖3可知，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度從20 ℃上升至30 ℃時(shí)，茶黃素各個(gè)單體的量及其總量均大幅增加，這說明在一定溫度內(nèi)，隨著溫度的上升，多酚氧化酶的活性增強(qiáng)，酶促氧化合成茶黃素的量增加；當(dāng)溫度上升至30 ℃后，TFs、TF、TF－3－G 及TF－3，－G 的合成量開始下降；當(dāng)溫度上升至40℃后，茶黃素各組分合成量均逐漸降低。

圖3 酶促反應(yīng)體系溫度對(duì)合成茶黃素的影響Figure 3 Effect of temperature in the reacting system on the systhsis of theaflavins

2.2.3 酶促反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成茶黃素的影響 由圖4可知，隨著酶促反應(yīng)時(shí)間的延長，茶黃素的合成量先逐步增加，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到120min時(shí)，單位質(zhì)量茶鮮葉酶促合成茶黃素的總量達(dá)到最大值，隨后茶黃素的合成總量開始下降。

2.2.4 酶源添加量對(duì)合成茶黃素的影響 由圖5可知，酶源添加量在0.2～0.6g／100mL時(shí)，反應(yīng)體系中茶黃素的合成總量隨酶源添加量而逐漸增加，其中TF的合成量增加明顯，當(dāng)酶源添加量在0.6～1.0g／100mL 時(shí)，各茶黃素組分的合成量無明顯變化，而茶黃素總量有逐漸下降的趨勢(shì)，這可能是茶黃素在酶的作用下，進(jìn)一步氧化聚合成茶紅素的緣故［13］。

圖4 酶促反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成茶黃素的影響Figure 4 Effect of enzymatic reacting time on the systhsis of theaflavins

圖5 不同酶源添加量對(duì)合成茶黃素的影響Figure 5 Effect of adding enzyme amount on the systhsis of theaflavins

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以政和大白春茶為原料，選擇酶促反應(yīng)體系pH 值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、酶源添加量4個(gè)因素，設(shè)置4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)（表4），試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 4 Orthogonal test design

由表5可知，在酶促反應(yīng)體系pH 值、反應(yīng)時(shí)間、溫度、酶源添加量4個(gè)影響因子中，對(duì)TFs影響大小的順序依次為B＞D＞A＞C，結(jié)合茶黃素總量的均值、極差分析結(jié)果，可以看出酶促合成茶黃素的最佳組合是B2D2A3C3，即反應(yīng)時(shí)間為120min、酶源添加量為0.6g／100mL、pH 值為5.2、反應(yīng)溫度為35 ℃。

表5 酶促合成茶黃素的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results of orthogonal test of enzyme synthesizing theaflavins

2.4 最優(yōu)組合驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

對(duì)獲得的最優(yōu)工藝技術(shù)組合A3B2C3D2進(jìn)行3 次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，3 次驗(yàn)證試驗(yàn)的茶黃素合成量分別為2.73，2.70，2.74mg／g·鮮葉，平均為2.72mg／g·鮮葉，說明所得工藝技術(shù)組合具有很好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，政和大白茶、秀紅、碧香早3種茶鮮葉原料在酶促氧化合成茶黃素的效率上存在較大差異，其中以政和大白茶鮮葉原料合成茶黃素的總量最多，最適合于酶促氧化合成茶黃素，這主要是由于3種茶鮮葉原料的兒茶素組成及其含量不同所致。政和大白茶鮮葉原料酶促氧化合成茶黃素最優(yōu)工藝技術(shù)參數(shù)：酶源用量為0.6g酶液／100mL，酶促反應(yīng)時(shí)間為120min，反應(yīng)體系溫度為35 ℃，反應(yīng)體系pH值為5.2。在該參數(shù)下，茶黃素的合成量達(dá)2.72 mg／g·鮮葉，說明所得工藝技術(shù)是一種利用茶鮮葉原料酶促氧化高效制備茶黃素的方法。

同時(shí)，試驗(yàn)過程中，由于酶促合成體系的量較小，酶促反應(yīng)料液與空氣接觸充分，有充足氧供給，所以沒有考慮通氧量的問題，但在工廠化酶促合成茶黃素的過程中，反應(yīng)體系的體積量較大，反應(yīng)料液很難與空氣或氧氣充分接觸，將會(huì)影響酶促合成茶黃素的效率。因此，當(dāng)工廠化酶促合成茶黃素時(shí)，尚需解決通氧的問題。

1 江和源，程啟坤，杜其珍.高效逆流色譜法分離純化茶黃素［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，12（4）：30～35.

2 王坤波，劉仲華，黃建安.茶黃素形成機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.茶葉通訊，2001，28（2）：34～36.

3 Lai Kwok Leung，Yalun Su，Ruoyun Chen.Theaflavins in black tea and catechins in green tea are equally effective antioxidants［J］.Journal of Nutrition，2001，131（9）：2 248～2 251.

4 Sarkar A，Bhaduri A.Black tea is a powerful chemopreventor of reactive oxygen andnitrogen species：Comparison with its individual catechin constituents and green tea［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，284（1）：173～178.

5 Lin Y L，Tsai S H，Lin－Shiau S Y，et al.Theaflavin－3，3’－digallate from black tea blocks the nitric oxide synthase by down－regulating the activation of NF－kappa B in macrophages［J］.European Journal of Pharmacology，1999，367（2～3）：379～388.

6 夏濤，高麗萍.茶鮮葉勻漿懸浮發(fā)酵體系優(yōu)化模型［J］.茶葉科學(xué)，1999，19（1）：55～60.

7 吳紅梅.多酚氧化酶酶源篩選及酶法制取茶色素研究［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

8 楊賢強(qiáng)，王岳飛.茶多酚化學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2003.

9 谷記平，劉仲華，黃建安，等.酸性氧化合成茶黃素條件優(yōu)化的研究［J］.茶葉科學(xué)，2006，26（4）：285～290.

10 Sanderson G W.The chemistry of tea and tea manufacturing［M］.NewYork：Academic Press，1972：247～316.

11 李大祥，宛曉春，夏濤，等.茶色素中茶黃素類的HPLC定量［J］.茶葉科學(xué)，2004，24（2）：124～128.

12 王坤波，劉仲華，趙淑娟，等.兒茶素組成和理化條件對(duì)茶黃素酶催化合成的影響［J］.茶葉科學(xué)，2007，27（3）：192～200.

13 王坤波.茶黃素的酶促合成、分離鑒定及功能研究［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.