微量循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

林 麗綜述 鄭 磊＊審校

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與，多因素、多步驟的復(fù)雜的生物學(xué)過程。腫瘤剛發(fā)生時(shí)多為器官局限性疾病，絕大多數(shù)腫瘤組織通過其脫落細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而侵襲其它臟器進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。早于1869年，Ashworth在一例腫瘤死亡患者外周血中發(fā)現(xiàn)了類似腫瘤細(xì)胞，并首次提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）的概念［1］。CTCs定義是指自發(fā)的或者因診療操作由實(shí)體瘤或者轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血中進(jìn)行循環(huán)的腫瘤細(xì)胞［2］。CTCs的檢測可能有效地應(yīng)用于體外早期診斷、化療藥物的快速評(píng)估、腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測以及抗腫瘤新藥物的開發(fā)等。但由于腫瘤患者血液中CTCs數(shù)量稀少，大約每105～107個(gè)單核細(xì)胞中才有一個(gè)CTCs［3］，而且其精確分離比較困難，因此限制了CTCs的應(yīng)用。近年來，隨著腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的深入，尤其是伴隨現(xiàn)代檢測技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)惡性腫瘤患者篩查并監(jiān)測CTCs逐漸被臨床所重視。目前針對(duì)CTCs的檢測技術(shù)主要包括細(xì)胞富集技術(shù)和鑒定技術(shù)兩大類。富集技術(shù)主要是通過一些物理或化學(xué)原理將這些細(xì)胞特異性地收集起來，提高CTCs檢測的敏感性；鑒定技術(shù)則主要依靠腫瘤細(xì)胞上存在的一些腫瘤特異性或器官特異性標(biāo)記以及腫瘤細(xì)胞本身的形態(tài)學(xué)特征來檢測CTCs。在實(shí)際操作中常常需要選擇兩者中的不同方法加以有效結(jié)合，以達(dá)到較高的檢測敏感性和特異性。本文就微量CTCs檢測技術(shù)的研究進(jìn)展作一綜述。

1 富集技術(shù)

1.1 細(xì)胞過濾技術(shù) （Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells，ISET）

ISET的基本原理是通過過濾工具將不同大小的CTCs和血液中其它細(xì)胞分離開來。其中，Vona等［4］建立的膜濾過法是利用上皮腫瘤細(xì)胞比外周血細(xì)胞大，而將上皮腫瘤細(xì)胞分離。該方法敏感度高，1ml血中只摻入1個(gè)腫瘤細(xì)胞也可檢出，分離得到的腫瘤細(xì)胞形態(tài)完整，表面各種抗原或分子標(biāo)記保存完好，為后續(xù)相關(guān)檢測提供了良好的條件。此外，該方法對(duì)設(shè)備、技術(shù)要求不高，過程易于掌握。但是膜濾過法只能用于分離直徑大于8μm的腫瘤細(xì)胞。由于目前還沒有報(bào)道證實(shí)所有的腫瘤細(xì)胞直徑都大于8μm，使其分離靈敏性受到質(zhì)疑［5］。而且所富集的細(xì)胞中不僅包括腫瘤細(xì)胞，也可能有不同種類的其它細(xì)胞（特別是單核細(xì)胞），使后續(xù)細(xì)胞鑒定結(jié)果出現(xiàn)假陽性，因而限制了本方法的應(yīng)用。

1.2 密度梯度離心法（Density Gradient Centrifugation，DGC）

DGC和ISET一樣，也是運(yùn)用物理方法富集和篩選有核細(xì)胞，其主要原理是采用特定介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力的作用使細(xì)胞分層、分離。離心后，從上往下依次是：血漿成分、單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等）、分離液、中性粒細(xì)胞和最下層的紅細(xì)胞。但是如果全血與分離液混合后不立即進(jìn)行離心，血細(xì)胞內(nèi)有可能摻入分離液而不利于分離，且腫瘤細(xì)胞有時(shí)可遷至血漿層，造成分離過程中丟失腫瘤細(xì)胞［6］。在此基礎(chǔ)上建立起來的OncoQuick分離法［7］，雖然對(duì)腫瘤細(xì)胞的平均回收率更高，富集效果更好，但在分離過程中仍可能丟失少量腫瘤細(xì)胞。

1.3 免疫磁珠分選法（Immunomagnetic Separation，IMS）

IMS是基于腫瘤細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結(jié)合，繼而在外加磁場中通過相應(yīng)抗原抗體復(fù)合物與磁珠吸附而滯留在磁場中，沒有表面抗原的其它細(xì)胞由于不能與連接磁珠的特異性單克隆抗體結(jié)合而不能在磁場中停留，從而使腫瘤細(xì)胞得以分離［2］。該方法能夠從多種細(xì)胞中篩選出帶有特異性標(biāo)記的極少量腫瘤細(xì)胞。而后發(fā)展的磁珠技術(shù)多采用上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）抗體來捕獲腫瘤細(xì)胞［8］，但其不足是EpCAM抗體結(jié)合磁珠存在著特異性差、結(jié)合能力低、易失活等缺點(diǎn)。針對(duì)抗體的缺點(diǎn)，Ellington等［9］用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichmen，SELEX）發(fā)現(xiàn)了能夠特異性結(jié)合于染料小分子的RNA配體，并命名為適配體（適體），以指代從SELEX技術(shù)中針對(duì)靶標(biāo)系統(tǒng)進(jìn)化出的核酸配體。適體具有特異性高、親和力強(qiáng)、易合成、易修飾等特點(diǎn)，因此近些年許多研究者著眼于利用EpCAM適體來提高腫瘤細(xì)胞的富集效率［10，11］。也有學(xué)者如 Xu等［12］發(fā)展了免疫磁珠分離方法，將表達(dá)去唾液酸蛋白受體的肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞與生物素化去唾液酸蛋白結(jié)合后，再與抗生物素抗體涂布的磁珠一起孵育，使去唾液酸蛋白與蛋白受體-磁珠結(jié)合來分離HCC。該方法平均回收率大于61%，較其它分離方法高，且平均每5ml外周血中可檢測到19±24個(gè)CTCs，是肝癌患者CTCs敏感而特異的分離和計(jì)數(shù)方法。

2 鑒定技術(shù)

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法（Immunocytochemistry，ICC）

ICC是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，使顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素等）標(biāo)記的抗體與特異的腫瘤標(biāo)志物如上皮細(xì)胞角蛋白（CK）、上皮細(xì)胞膜特異性抗原、腫瘤相關(guān)糖蛋白（TAG）等結(jié)合，通過酶和底物反應(yīng)顯色等方法來鑒定腫瘤細(xì)胞的存在。與核酸分離方法相比，免疫細(xì)胞化學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)在于腫瘤細(xì)胞未被破壞，可以進(jìn)行后續(xù)形態(tài)學(xué)鑒別或核酸特征分析。但不足之處是缺乏腫瘤特異性抗體，敏感性也低，只能從（1～10）×105個(gè)正常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)1個(gè)腫瘤細(xì)胞，且每個(gè)載玻片上所能檢測的細(xì)胞載量僅為5×105個(gè)細(xì)胞［13］，難以從外周血大量單核細(xì)胞中檢測出極少量的腫瘤細(xì)胞，難以滿足臨床診斷需要。為了能在更大范圍檢測到外周血中稀少的腫瘤細(xì)胞，近年來研發(fā)出光纖陣列掃描術(shù)（Fiber Array Scanning Technology，F(xiàn)AST）［14］，激光掃描細(xì)胞計(jì)量儀（Laserscanning Cytometry，LSC）［15］等，它們能夠在傳統(tǒng)的顯微鏡技術(shù)基礎(chǔ)上高速掃描并快速、準(zhǔn)確定位免疫熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，使檢測敏感性和實(shí)用性得到顯著提高。

2.2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

PCR技術(shù)檢測腫瘤患者外周血中CTCs主要是通過檢測癌基因、抑癌基因的突變或染色體異位產(chǎn)生的異常DNA。雖然敏感性高［能從（1～10）×106個(gè)正常細(xì)胞中檢測出1個(gè)腫瘤細(xì)胞］，但是由于其易出現(xiàn)假陽性，適用范圍有限，而且外周血中CTCs和核酸的半衰期不穩(wěn)定，檢測到的游離DNA可能并非真正腫瘤細(xì)胞，因此應(yīng)用PCR技術(shù)通過DNA標(biāo)記檢測CTCs的特異性不高，在臨床實(shí)踐中還不能達(dá)到理想的效果［16］。RT-PCR檢測CTCs是在PCR基礎(chǔ)上擴(kuò)增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA片段，從而識(shí)別組織或腫瘤特異性mRNA的表達(dá)或某些基因改變后RNA水平的異常。這些mRNA幾乎不表達(dá)于正常外周血細(xì)胞，所以在外周血中檢測到特異mRNA可以間接提示CTCs的存在。與PCR技術(shù)相比，盡管RT-PCR可確認(rèn)某些基因的表達(dá)，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞mRNA表達(dá)的鑒別能力，但其存在的取樣時(shí)上皮細(xì)胞污染、腫瘤標(biāo)志物在外周血的非正常表達(dá)或者假基因干擾等原因可導(dǎo)致假陽性結(jié)果，另外，RT-PCR無法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及對(duì)腫瘤細(xì)胞定量是影響它應(yīng)用于CTCs檢測的最大障礙。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）

FCM是一種集激光、電子物理、光電測量、計(jì)算機(jī)、細(xì)胞熒光化學(xué)和單克隆抗體為一體的新型技術(shù)，主要用于腫瘤細(xì)胞DNA分析以及腫瘤相關(guān)標(biāo)志物檢測。利用腫瘤細(xì)胞單克隆抗體結(jié)合熒光物質(zhì)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，可以對(duì)外周血樣本中的CTCs進(jìn)行精確定量計(jì)數(shù)，以及檢測細(xì)胞DNA含量，預(yù)測腫瘤預(yù)后等。具有分析速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。Fusi等［17］采用FCM探討了轉(zhuǎn)移性腫瘤（MC）和黑色素瘤（MM）的CTCs中趨化因子受體（CR，包括CXCR4、CCR6、CCR7和CCR9）的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTCs的檢測效率達(dá)到72%，平均每10ml血液中檢測到3個(gè)CTC；在檢測到CTC的患者中，趨化因子受體CXCR4表達(dá)最高，達(dá)82%，CCR6表達(dá)為59%；在MM患者中，CCR9表達(dá)為57%，而CR7表達(dá)只有29%，這種準(zhǔn)確測量表明CTC與細(xì)胞表面CR表達(dá)呈正相關(guān)，與器官特異性轉(zhuǎn)移模式無顯著相關(guān)性。Hristozova等［18］利 用FCM 分析CD45的EpCAM 和CK陽性的CTC對(duì)晚期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（SCCHN）傳播的作用，結(jié)果顯示這種CTCs與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌區(qū)域性轉(zhuǎn)移有關(guān)。不過，單純依賴FCM測定CTCs的敏感性仍存在爭議，建議通過與細(xì)胞富集技術(shù)（如磁珠富集）聯(lián)合，以提高FCM的敏感性和鑒別力，提高CTCs的陽性檢出率。

2.4 微流控技術(shù)（Microfluidics）

芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-Chip）是一個(gè)新興領(lǐng)域，原則上所有生物與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室功能的微型化手段都可以用“芯片實(shí)驗(yàn)室”技術(shù)來指代。而其概念中的代表性技術(shù)就是針對(duì)小尺度液體操控的微流控技術(shù)。微流控技術(shù)可在微米級(jí)結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升體積流體，是近十年來迅速崛起的前沿交叉學(xué)科。Xu等［19］即用聚對(duì)二甲苯-C槽微流控裝置捕獲了有活性CTCs中的端粒酶。使用一個(gè)衡量低壓傳輸系統(tǒng)的新微流控技術(shù)平臺(tái)能在5min內(nèi)從1ml全血實(shí)現(xiàn)90%CTCs捕獲和90%細(xì)胞活力。更重要的是，捕獲的CTCs經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察，其形態(tài)保持正常。此方法能捕獲和鑒定有活性CTCs，具有快速、簡便且準(zhǔn)確定量的優(yōu)勢，而且適用于任何實(shí)體瘤，有望成為一種新的CTCs定量檢測和表征方法。

Lin等［20］將健康志愿者血標(biāo)本中摻入腫瘤細(xì)胞，來評(píng)估微流控技術(shù)捕獲CTC的敏感性，發(fā)現(xiàn)微流控裝置能從摻入5個(gè)CTC的7.5ml血中，至少檢測到1個(gè)CTC，并有大于90%的復(fù)蘇率。較多研究者［21～24］在微流控技術(shù)，特別在聯(lián)合運(yùn)用適體或磁珠微流控技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞做了很多工作，有力地推進(jìn)了微流控技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。目前基于微流控技術(shù)用于檢測腫瘤細(xì)胞最有運(yùn)用前景的是微流控芯片，它把生物和化學(xué)等領(lǐng)域所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離與檢測等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米的芯片上，具有快速、高效、高靈敏度等諸多優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室分析的優(yōu)良工具。微流控芯片技術(shù)進(jìn)行CTCs檢測尚處起步階段，在芯片設(shè)計(jì)、材料選用、檢測技術(shù)聯(lián)用等方面仍存在許多不足，但它的出現(xiàn)已為CTCs檢測技術(shù)的發(fā)展提供了新的方法和思路。

3 富集與鑒定技術(shù)的結(jié)合

如上所述，目前用于CTCs檢測的方法很多，實(shí)際臨床應(yīng)用中常常選擇不同方法的有效結(jié)合，使用最多的也是目前自動(dòng)化程度最高的 系統(tǒng)［25］，該系統(tǒng)集免疫磁珠富集技術(shù)和免疫熒光技術(shù)于一體，人為因素干擾較少，具有較高的特異性、敏感性及可重復(fù)性，是目前唯一被美國FDA批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌或前列腺癌CTCs檢測的新技術(shù)［26］。其主要原理是用一種攜帶鐵微粒的抗體與CTCs特異性結(jié)合，再用強(qiáng)磁體將這些CTCs從血液樣本中提出，并進(jìn)行生物或化學(xué)染色，從而準(zhǔn)確識(shí)別CTCs。CellSearch系統(tǒng)檢測CTCs的效果已被許多研究者用于臨床，Gazzaniga等［27］用CellSearch系統(tǒng)分析CTC對(duì)非肌肉侵蝕性膀胱（NIMIBC）的影響，發(fā)現(xiàn)CTC的存在與NIMIBC首次復(fù)發(fā)的時(shí)間長短密切相關(guān)；NIMIBC中檢測CTC能區(qū)分高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，有利于腫瘤的早期診斷。Farace等［28］用CellSearch系統(tǒng)和ISET檢測了轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和肺癌共60例患者的CTCs，結(jié)果顯示乳腺癌CTCs檢測率55%、前列腺癌60%、肺癌20%，這種差異主要取決于腫瘤類型。

最近，許多學(xué)者研究了一些新的用于檢測CTCs的方法。Hughes等［29］設(shè)計(jì)的檢測CTC的微量流動(dòng)裝置是利用E-選擇素和針對(duì)上皮細(xì)胞的抗體分子，采用埃洛石納米顆粒和納米材料合成，該裝置CTCs捕獲率大約為50%，可以從3.75ml樣本中分離到20～704個(gè)CTC，高于CellSearch系統(tǒng)的捕獲率（P＜0.01）；Kirb等［30］發(fā)明了一種提高捕獲率，減少非特異性細(xì)胞黏附的方法——GEDI（幾何學(xué)提高特異性免疫捕獲）微流量裝置，該裝置將前列腺特異性膜抗原（PSMA）抗體和3維（Three Dimensional，3D）立體幾何學(xué)結(jié)合，結(jié)果顯示該裝置敏感度比CellSearch系統(tǒng)提高2～400倍；還有研究者［31］將鄰位連接技術(shù)（PLA）和針對(duì)細(xì)胞表面的特異性RNA適體結(jié)合起來用于檢測CTCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種方法能特異地檢測和區(qū)分特異性表達(dá)前列腺癌膜抗原（PMA）的腫瘤細(xì)胞，雖然特異性和敏感度不夠明確，但其應(yīng)用前景還是十分樂觀的。

4 小 結(jié)

近年來，CTCs檢測作為一種可重復(fù)的非侵入性診斷工具，在實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷及預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮著越來越重要的作用。目前CTCs的檢測方法多種多樣，在一定程度上滿足了臨床需求，但都存在一定的缺點(diǎn)而影響其廣泛應(yīng)用，如PCR被認(rèn)為是檢測CTCs和轉(zhuǎn)移性腫瘤的理想而常規(guī)的技術(shù)之一，然而PCR陽性并不意味著疾病復(fù)發(fā)；聯(lián)合RTPCR、流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法能大大提高腫瘤細(xì)胞的臨床價(jià)值，但真正已經(jīng)進(jìn)入臨床的只有CellSearch系統(tǒng)，其它方法仍處于研究階段。而臨床診斷卻渴求更為快速、簡便的分析方法來捕獲特異性CTCs。新技術(shù)的出現(xiàn)將給CTCs檢測方法的發(fā)展帶來機(jī)遇，如微流控芯片的出現(xiàn)為CTCs檢測實(shí)現(xiàn)臨床個(gè)體化治療提供了新的技術(shù)平臺(tái)，而PLA和適體聯(lián)用也將成為未來CTCs檢測研究的熱點(diǎn)?？傊?，CTCs檢測有望成為一種具有高度可行性、信息含量豐富且準(zhǔn)確的新型診斷方法，從而為腫瘤患者的診治帶來新的希望。

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