隱球菌形態(tài)學(xué)變化及其致病機(jī)制

潘搏，陳敏，潘煒華，廖萬(wàn)清

上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所/上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/全軍真菌與真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海 200003

致病真菌在與宿主相互作用過(guò)程中會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，如白假絲酵母在不同感染階段會(huì)產(chǎn)生假菌絲和真菌絲，這種形態(tài)學(xué)變化與真菌的組織嗜性和系統(tǒng)播散有密切關(guān)系。菌絲形態(tài)可增強(qiáng)真菌在組織中的侵襲性，酵母形態(tài)則有助于真菌通過(guò)血液和淋巴系統(tǒng)形成系統(tǒng)播散[1]。而雙相型真菌如組織胞漿菌和皮炎芽生菌表現(xiàn)出溫度介導(dǎo)的形態(tài)變化，在體外環(huán)境中表現(xiàn)為菌絲態(tài)，在人體37 ℃體溫下表現(xiàn)為酵母相。

隱球菌病是由隱球菌引起的一種嚴(yán)重深部真菌病，世界各地均有流行，每年約造成62萬(wàn)人死亡。常見(jiàn)的致病隱球菌主要有新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)和格特隱球菌(Cryptococcusgattii)，其他少見(jiàn)的致病菌包括羅倫隱球菌和淺白隱球菌。中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺和皮膚是該病的常見(jiàn)感染部位。與其他真菌相比，隱球菌菌體外周有莢膜包繞，這是其最顯著的形態(tài)學(xué)特征，也是直接通過(guò)腦脊液墨汁染色診斷該病的原因之一。同時(shí)，莢膜是隱球菌的主要毒力因子，會(huì)隨著所處環(huán)境的不同發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，這有利于隱球菌適應(yīng)環(huán)境壓力。此外，隱球菌孢子(spore)形成和巨大菌體的變化與該病的發(fā)生也有密切關(guān)系。本文就隱球菌的形態(tài)學(xué)變化與其致病機(jī)制的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 孢子形成與吸入感染

目前認(rèn)為，隱球菌的自然感染途徑主要是呼吸道吸入方式。在宿主免疫缺陷時(shí)，被吸入的隱球菌無(wú)法被免疫細(xì)胞清除，隨之播散到其他組織器官，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2]。環(huán)境中干燥的隱球菌和隱球菌孢子被認(rèn)為是可能吸入的病原菌原型。但干燥的隱球菌(直徑3 μm)易在環(huán)境播散過(guò)程中死亡，而隱球菌孢子(直徑1～2 μm)有更好的環(huán)境適應(yīng)能力，更易在外界環(huán)境中存活和被宿主吸入[3-5]。

隱球菌孢子可通過(guò)2種不同途徑生成，即有性交配(sexual development)和單核體結(jié)實(shí)(monokaryotic fruiting)。有性交配過(guò)程是隱球菌α和a交配型(MATα和MATa)的單倍體細(xì)胞在合適外界環(huán)境中發(fā)生融合，產(chǎn)生菌絲，其末端菌絲細(xì)胞分化為擔(dān)子，經(jīng)核融合和減數(shù)分裂在擔(dān)子表面產(chǎn)生孢子長(zhǎng)鏈[6]。這種有性生殖方式更有利于2種交配型孢子的產(chǎn)生和播散[6]。而單核體結(jié)實(shí)則發(fā)生在外界營(yíng)養(yǎng)匱乏的情況下，即使沒(méi)有MATa交配型，2株MATα間也可發(fā)生同性交配，細(xì)胞融合生成單核菌絲，再通過(guò)減數(shù)分裂產(chǎn)生重組擔(dān)孢子[7]。1999年至今在溫哥華島暴發(fā)流行的隱球菌病多累及免疫力正常的宿主，對(duì)致病菌交配型位點(diǎn)基因分析發(fā)現(xiàn)，主要致病株VGⅡa亞型隱球菌由MATα交配型的格特隱球菌同性交配產(chǎn)生。有學(xué)者認(rèn)為，這種單核產(chǎn)物的生殖方式可能會(huì)增強(qiáng)隱球菌的毒力[8]。

由于既往缺乏分離隱球菌孢子的手段，沒(méi)有對(duì)這種有性孢子進(jìn)行深入研究。隨著顯微解剖技術(shù)(microdissection)和密度梯度離心方法的出現(xiàn)，為研究該菌孢子生理、生化特性和模擬自然感染過(guò)程提供了可能[3,5]。電子顯微鏡下隱球菌孢子有很厚的孢壁(spore coat)，而干燥隱球菌沒(méi)有該結(jié)構(gòu)[3]。孢壁使孢子擁有很強(qiáng)的抵抗外界傷害的能力。與干燥酵母細(xì)胞相比，它更能抵御干燥、高溫的環(huán)境[3]。

隱球菌吸入感染小鼠模型顯示，500個(gè)新生隱球菌孢子足以造成致死性感染[5]。但與吸入酵母樣菌體的小鼠相比，吸入孢子的小鼠在感染3 d和6 d后肺內(nèi)菌體量明顯減少，說(shuō)明隱球菌孢子可能更容易被免疫細(xì)胞吞噬[4]。孢子與小鼠巨噬細(xì)胞共孵育的實(shí)驗(yàn)也顯示，這種孢子更容易被巨噬細(xì)胞吞噬，且這種吞噬作用不依賴調(diào)理素(opsonin)介導(dǎo)[4,5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種吞噬孢子的作用由隱球菌孢子β-1,3-葡聚糖、巨噬細(xì)胞dectin 1受體和白細(xì)胞黏附分子CD11b所介導(dǎo)[4]。雖然巨噬細(xì)胞的吞噬作用可殺滅病原菌，但在缺少脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和γ干擾素(interferon γ, IFN-γ)活化巨噬細(xì)胞的情況下，部分被吞噬的孢子可在巨噬細(xì)胞內(nèi)萌發(fā)(germination)和增殖。在上述2種物質(zhì)活化巨噬細(xì)胞的情況下，胞內(nèi)隱球菌孢子被快速殺滅，這種殺傷作用依賴于巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧和活性氮(reactive oxygen and nitrogen)[4]。而孢子萌發(fā)后形成的酵母樣細(xì)胞可抵抗上述2種物質(zhì)的殺傷[9]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，隱球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存與其在宿主體內(nèi)播散、致病有密切關(guān)系[10,11]。

隱球菌孢子易被巨噬細(xì)胞吞噬和殺滅與其在動(dòng)物模型中的致病能力相互矛盾。Botts等提出一種動(dòng)態(tài)模型(kinetic model)來(lái)解釋這種“矛盾”。他們認(rèn)為，盡管巨噬細(xì)胞活化使大多數(shù)胞內(nèi)孢子被殺滅，但少數(shù)未經(jīng)活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)孢子暫時(shí)逃避了這種殺傷作用[9]。這些未被殺滅的孢子在巨噬細(xì)胞活化并萌發(fā)，形成能抵抗巨噬細(xì)胞殺傷的酵母樣細(xì)胞并將巨噬細(xì)胞作為“特洛伊木馬”(Trojan horse)造成全身播散[10]。在該動(dòng)態(tài)模型中，巨噬細(xì)胞活化是隱球菌孢子能否致病的關(guān)鍵所在。免疫功能正常的宿主可及時(shí)殺死和清除胞內(nèi)的萌發(fā)孢子，使宿主免于感染；而免疫功能受損的宿主無(wú)法在孢子萌發(fā)“窗口期”(window of germination)內(nèi)激活初始免疫反應(yīng)而及時(shí)殺傷孢子，使孢子萌發(fā)形成可抵抗巨噬細(xì)胞殺傷作用的酵母樣細(xì)胞[9]。如獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞因受病毒感染，天然免疫反應(yīng)低下或延遲，從而成為易感人群[12]。

由于肺泡巨噬細(xì)胞是隱球菌侵入宿主所面臨的第1道防線，隱球菌突破該防線的過(guò)程等同于孢子萌發(fā)與宿主天然免疫“賽跑”的過(guò)程，其結(jié)果決定了吸入肺內(nèi)的隱球菌是被宿主清除還是在胞內(nèi)存活及致病。

2 莢膜變化與環(huán)境適應(yīng)

如前所述，菌體外包繞的厚壁莢膜是隱球菌最顯著的形態(tài)學(xué)特征。隱球菌的莢膜主要由葡糖醛木甘聚糖(glucuronoxylomannan, GXM)、半乳木糖甘露聚糖(galactoxylomannan, GalXM)和甘露糖蛋白(mannoprotein)組成。不同血清型的隱球菌莢膜GXM成分及總木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸摩爾比值不同。

研究發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，隱球菌莢膜基因缺陷的菌株感染能力下降。莢膜大小與生長(zhǎng)環(huán)境有密切關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和外界環(huán)境中隱球菌莢膜較小，而宿主肺泡內(nèi)和巨噬細(xì)胞內(nèi)隱球菌莢膜體積明顯增大[13,14]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中CO2濃度升高、鐵離子濃度降低、營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)，莢膜會(huì)顯著增大。另外，環(huán)境滲透壓、pH值和二價(jià)離子濃度變化也會(huì)影響莢膜體積[15]。最新研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌與巨噬細(xì)胞和阿米巴原蟲(chóng)共孵育時(shí)會(huì)導(dǎo)致莢膜變大，此過(guò)程由共孵育細(xì)胞的磷脂類(lèi)物質(zhì)介導(dǎo)，這是首次發(fā)現(xiàn)能介導(dǎo)隱球菌莢膜變化的宿主自身分子[16]。

Zaragoza等用補(bǔ)體標(biāo)記莢膜和放射性氚標(biāo)記甘露糖的方法研究了莢膜增大的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在莢膜增大過(guò)程中原有莢膜位置不變，仍緊貼細(xì)胞壁，在其外側(cè)產(chǎn)生新生莢膜[17]。動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)揭示了莢膜增大的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)隱球菌生成的莢膜多糖(包括GXM和GalXM)分子的有效直徑(effective diameter)與莢膜直徑呈線性關(guān)系，莢膜變大的過(guò)程也是上述多糖分子有效直徑變化的過(guò)程[18]。

隱球菌胞壁外的莢膜、脫落至宿主內(nèi)環(huán)境中的莢膜和吞噬細(xì)胞內(nèi)脫落的莢膜可通過(guò)多種機(jī)制保護(hù)隱球菌免受宿主殺傷。巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷作用是天然免疫過(guò)程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌莢膜體積與抗體和補(bǔ)體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬作用呈負(fù)相關(guān)。即莢膜越大，越不易被吞噬[19]；且莢膜增大后，內(nèi)層原有莢膜密度增大，可明顯減少外源性物質(zhì)的滲透[17]。此外，在培養(yǎng)基和宿主體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)隱球菌存在莢膜脫落現(xiàn)象，這種脫落至宿主內(nèi)環(huán)境中的莢膜多糖與隱球菌胞壁外的莢膜成分和性質(zhì)均不同[20]。脫落的莢膜可調(diào)節(jié)宿主免疫功能，如這些莢膜中的GXM和GalXM可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞凋亡[21]。在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存、增殖有助于隱球菌逃避宿主免疫和抗真菌藥物的殺傷作用。但巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境惡劣，隱球菌需要表達(dá)一系列毒力因子來(lái)適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)證明，隱球菌被巨噬細(xì)胞吞噬后莢膜體積顯著增大，增大的莢膜可幫助其抵御巨噬細(xì)胞內(nèi)氮、氧自由基的殺傷作用，這種抵抗殺傷的作用與莢膜大小成正比[14]。

由此可見(jiàn)，隱球菌莢膜體積的變化與外界環(huán)境息息相關(guān)。增大的莢膜可通過(guò)自身體積增大和結(jié)構(gòu)變化增強(qiáng)隱球菌抵御外界不利生存環(huán)境的能力。

3 巨大菌體與潛伏感染

在宿主體內(nèi)，除可觀察到隱球菌莢膜的形態(tài)學(xué)變化，還可見(jiàn)菌體變大的現(xiàn)象。這種變大的菌體體積(不包括莢膜)是酵母樣隱球菌的5～10倍。另外，大菌體隱球菌還表現(xiàn)出細(xì)胞壁增厚、染色體數(shù)目增加和抗氧化損傷的特性，所以有學(xué)者將其稱為“titan cell”[22]。其實(shí)，先前就有學(xué)者在隱球菌患者的肺、腦和腦膜組織中發(fā)現(xiàn)這種巨型隱球菌，菌體直徑可達(dá)25～30 μm，而體外培養(yǎng)的酵母樣隱球菌的菌體平均直徑為4.5 μm，但當(dāng)時(shí)未對(duì)其產(chǎn)生原因進(jìn)行深入研究[13,23]。

最近2項(xiàng)研究通過(guò)分析經(jīng)呼吸道感染小鼠肺組織中的巨型隱球菌，揭示了這種形態(tài)學(xué)變化在隱球菌致病過(guò)程中的作用[22,24]。Zaragoza等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)呼吸道感染的免疫力正常小鼠，肺組織中巨大菌體占所有隱球菌的10%～80%，且肺內(nèi)隱球菌接種量的多少與巨型隱球菌產(chǎn)生比例成反比[24]。Okagaki等發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)呼吸道接種隱球菌3 d后，肺組織中菌體直徑>10 μm的隱球菌約占20%，部分菌體直徑甚至達(dá)到50～100 μm(不包括莢膜)[22]。將這種巨大菌體的隱球菌置于體外培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，它仍保持自身巨大形態(tài)，但可通過(guò)出芽、生殖，快速產(chǎn)生小的酵母樣子代隱球菌[24]。同時(shí)，這2項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)巨型隱球菌是單核多倍體(四倍體或八倍體)，DNA含量和染色體數(shù)目較一般隱球菌明顯增多，這是因?yàn)殡[球菌形態(tài)變化過(guò)程中發(fā)生不伴隨細(xì)胞分裂的DNA復(fù)制(DNA replication without fission)[22,24]。由此可見(jiàn)，隱球菌巨大菌體的形成與隱球菌獨(dú)特的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)方式有關(guān)，但具體機(jī)制尚待研究。

培養(yǎng)過(guò)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基和缺鐵條件均可在體外誘導(dǎo)巨大菌體形成[24,25]。在研究新生隱球菌交配型過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隱球菌MATα菌株產(chǎn)生的信息素(pheromone)可使交配型MATa隱球菌菌體變大，而MATa產(chǎn)生的信息素可使MATα形成萌發(fā)芽管(germ tube)[26]。Okagaki等發(fā)現(xiàn)MATa和MATα單獨(dú)感染時(shí)均可在小鼠肺組織中形成巨型隱球菌，但兩者混合接種于小鼠肺內(nèi)會(huì)使更多的MATa型隱球菌菌體變大，而發(fā)生形態(tài)學(xué)改變的MATα菌比例同前[22]。最近研究發(fā)現(xiàn)，巨大菌體的產(chǎn)生受2種G蛋白耦聯(lián)受體﹝Ste3a信息素受體(pheromone receptor)和Gpr5 受體﹞調(diào)控，這2種受體通過(guò)cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Rim101，導(dǎo)致隱球菌細(xì)胞周期和分裂方式改變，產(chǎn)生巨大菌體[25]。由此可見(jiàn)，隱球菌菌體變化是由外界環(huán)境和宿主內(nèi)環(huán)境共同介導(dǎo)的復(fù)雜過(guò)程。

在巨型隱球菌與巨噬細(xì)胞共孵育實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，因?yàn)轶w積過(guò)大，巨噬細(xì)胞無(wú)法吞噬這種巨型隱球菌。鑒于巨型隱球菌多存在于免疫功能正常的小鼠體內(nèi)，并與致病菌接種量成反比，且在合適條件下可產(chǎn)生子代細(xì)胞，有學(xué)者認(rèn)為這種巨型隱球菌作為隱球菌感染階段的一個(gè)亞群(subpopulation)，是呼吸道隱球菌潛伏感染的原型[22,24]。巨型菌體可保護(hù)隱球菌不被宿主巨噬細(xì)胞吞噬，延長(zhǎng)在宿主體內(nèi)胞外潛伏時(shí)間，且自身內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生的多倍體可使其在合適條件下快速產(chǎn)生子代細(xì)胞[24]。吸入感染造模過(guò)程顯示，吸入感染1 d后即可在小鼠肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)巨型隱球菌，感染7 d后巨型隱球菌所占比例趨于穩(wěn)定，說(shuō)明巨型隱球菌可能僅在感染早期發(fā)揮作用[22]。而在不同交配型共感染實(shí)驗(yàn)中，雖然肺內(nèi)MATa巨型隱球菌比例增加，但對(duì)感染小鼠的生存時(shí)間無(wú)影響[22]。這些結(jié)果均提示巨型隱球菌潛伏感染存在的可能。

類(lèi)似的潛伏機(jī)制也存在于肺孢子菌(Pneumocystis)和球孢子菌(Coccidioides)的致病過(guò)程中。肺孢子菌和球孢子菌可在宿主體內(nèi)分別生成孢囊(cyst)和內(nèi)孢囊(spherule)，抵御肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬，并能在孢囊成熟后發(fā)生破裂，釋放其中所含的孢子從而致病[27,28]。而隱球菌巨大菌體也可抵御巨噬細(xì)胞的吞噬，且可在合適條件下快速出芽、生殖，產(chǎn)生子代細(xì)胞。這與前兩者的潛伏機(jī)制有異曲同工之處。

4 展望

抵抗力強(qiáng)、體積小的隱球菌孢子有利于通過(guò)吸入途徑進(jìn)入宿主體內(nèi)，而巨大菌體形成和莢膜變大分別在潛伏感染和適應(yīng)環(huán)境過(guò)程中發(fā)揮重要作用。新技術(shù)的出現(xiàn)為人們研究隱球菌形態(tài)學(xué)變化的意義提供了可能，可直接觀察致病菌與宿主細(xì)胞相互作用的過(guò)程。目前仍需更多研究從分子和基因角度闡述這些過(guò)程，這對(duì)防治該病有重要意義。另外，還有許多問(wèn)題需要人們?nèi)ヌ剿?，如孢子吸入與潛伏感染之間的聯(lián)系，兩者是承前啟后的關(guān)系，還是平行進(jìn)行的？同時(shí)，人類(lèi)和動(dòng)物并不是隱球菌的主要生態(tài)環(huán)境(ecologic niche)，隱球菌進(jìn)化擁有的這種形態(tài)學(xué)變化能力可能并不是用于抵御非天然宿主的免疫反應(yīng)，這提示人們尋找其他天然模式生物(如阿米巴原蟲(chóng)、蠟蛾)來(lái)更好地研究隱球菌形態(tài)學(xué)變化的分子調(diào)控機(jī)制[16]。

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