組蛋白去乙?；?在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義*

華方方， 夏永華， 陳瑞香， 王玉紅， 潘 瑩， 楊 君， 梁武風(fēng)△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2皮膚科，河南新鄉(xiāng)453100;3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南新鄉(xiāng)453003)

宮頸癌(cervical cancer)是全球婦女最普遍的腫瘤之一，每年全球估計有470 000新病例發(fā)生和大約233 000病例死亡［1-2］。盡管大約90%以上的宮頸癌與高致癌風(fēng)險的人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染密切相關(guān)［3-4］，但單獨的HPV尚不足以誘導(dǎo)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化，許多其它尚未被鑒定的基因可能參與到宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中［5］。因此鑒定新的基因作為宮頸癌篩查、診斷和治療的分子標(biāo)記顯得十分重要。

組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 6，HDAC6)的基因定位于人染色體Xp11.23［6-7］。HDAC6是一種比較獨特的組蛋白去乙?；?，具有2個功能性的去乙?；Y(jié)構(gòu)域和1個鋅指基序［8-9］。HDAC6作為一種微管蛋白去乙酰化酶能夠通過去乙?；蕾囆院头且蕾囆缘姆绞秸{(diào)控微管蛋白的解聚［10］，但是最近發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括乳腺癌［11］、卵巢癌［12］、口腔癌［13］、胃癌［14］和結(jié)腸癌［14］等。但是迄今為止，尚未見任何關(guān)于HDAC6在宮頸癌中的研究報道，因此在本研究中，我們利用免疫組織化學(xué)和Western blotting方法研究宮頸癌組織中HDAC6蛋白的表達(dá)，并研究其可能的臨床意義，該研究旨在為以HDAC6為分子靶點的宮頸癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1 組織標(biāo)本

63例宮頸癌組織、38例宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)組織和63例正常宮頸上皮組織取自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2006～2009年手術(shù)切除標(biāo)本，并經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。其中隨機(jī)選取4例宮頸癌組織［經(jīng)病理學(xué)診斷隨機(jī)選取，2例為IIa期(低分化)，1例為Ia1期(中分化)，1例為Ia2期(高分化)］和自身相對應(yīng)的正常宮頸上皮組織取樣后液氮保存?zhèn)溆?，行Western blotting分析。所有患者術(shù)前均未接受任何形式的治療，包括放療、化療和免疫治療。患者年齡25～73歲，中位年齡41歲，其中≥45歲的43例，＜45歲的20例。按2000年FIGO分期:Ia期18例，Ib1期16例，Ib2期18例，IIa期11例。組織學(xué)分級:高分化15例，中分化32例，低分化16例。宮頸癌標(biāo)本中有14例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。浸潤深度:≤1/2層30例，＞1/2層25例，全層8例。

2 方法

2.1 免疫組織化學(xué) HDAC6鼠抗人單克隆抗體購自Santa Cruz，免疫組織化學(xué)SP試劑盒和DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)染色步驟參照使用說明書進(jìn)行操作。HDAC6Ⅰ抗稀釋濃度為1∶50。以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照，以已知的陽性宮頸癌切片為陽性對照。

2.2 結(jié)果評估 以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。具體的判定方法按參考文獻(xiàn)［15］執(zhí)行，即按照細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)建立評定方法。隨機(jī)計數(shù)5個高倍視野，每例標(biāo)本至少評價1 000個細(xì)胞。染色強(qiáng)度:輕度著色，1分;中度著色，2分;強(qiáng)染色，3分。陽性細(xì)胞＜10% 為1分;10%≤陽性細(xì)胞＜50%為2分;50%≤陽性細(xì)胞＜80%為3分;≥80%為4分。將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)比率相乘得到每個病例染色的總分。總分1～3分為陰性;總分4～12分為陽性。

2.3 Western blotting 將組織從液氮中取出，研磨后，用組織蛋白裂解液提取總蛋白，然后將提取的總蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳。電泳結(jié)束后，取下凝膠電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST液封閉NC膜2 h，加入Ⅰ抗(HDAC6)(1∶100)，4℃ 搖床孵育過夜。加入Ⅱ抗室溫孵育2 h。將NC膜置于ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑)中反應(yīng)1～3 min，于暗室中利用X射線曝光，常規(guī)方法顯影定影，顯示特異的蛋白信號。蛋白表達(dá)的灰度值利用Image-Pro Plus 5.0軟件進(jìn)行分析，蛋白相對表達(dá)為目的基因與內(nèi)參基因的比值，β-actin作為內(nèi)參照。每例樣品做3次實驗，取平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行比較。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。采用χ2和t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 不同宮頸組織中HDAC6蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)方法檢測63例宮頸癌組織、38例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和63例正常宮頸上皮組織中HDAC6蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，HDAC6蛋白主要定位于宮頸癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈淺黃色至棕黃色顆粒，見圖1。HDAC6蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)的陽性率(80.95%)顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織(39.47%)和正常宮頸上皮組織(11.11%)，3組之間HDAC6蛋白的表達(dá)有顯著差異(χ2=62.718，P＜0.01)，見表1。

Figure 1.Expression of HDAC6 protein in different cervical tissues(×400).A:normal cervical epithelial tissue; B: cervical intraepithelial neoplasia; C: cervical cancer tissue.圖1 HDAC6蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá)

表1 HDAC6蛋白在宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和正常宮頸上皮組織中的表達(dá)Table 1 .Expression of HDAC6 protein in cervical cancer cervical intraepithelial neoplasia and normal cervical epithelial tissues

2 HDAC6蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系

表2顯示，HDAC6蛋白的表達(dá)與宮頸癌患者的年齡和組織分化程度無關(guān)(P＞0.05)，但與臨床分期、浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均關(guān)系密切(P＜0.01或P＜0.05)。

表2 HDAC6蛋白表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 2 .Correlation between the level of HDAC6 protein and clinicopathological parameters in the patients with cervical cancer

3 Western blotting檢測宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織中HDAC6蛋白的表達(dá)

隨機(jī)選取的4例宮頸癌組織中HDAC6蛋白的表達(dá)均顯著高于其對應(yīng)的正常宮頸上皮組織(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Expression of HDAC6 protein in cervical cancer tissues (T)and normal cervical epithelial tissues(N).±s.n=4.*P＜0.05 vs N.圖2 HDAC6蛋白在宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織中的表達(dá)

討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與組蛋白的乙酰化和去乙?；g關(guān)系密切。組蛋白乙?；軌蛘T導(dǎo)染色質(zhì)松弛和基因的轉(zhuǎn)錄，而去乙?；軌蚴沟萌旧|(zhì)凝集和轉(zhuǎn)錄停滯。組蛋白的乙?；ㄟ^組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶在特定的賴氨酸殘基上實現(xiàn)，組蛋白去乙?；复呋嫦蚍磻?yīng)。HDAC6是一種獨特的組蛋白去乙?；?，既能牽涉到組蛋白的去乙?；?］，也能影響細(xì)胞質(zhì)非組蛋白的功能［16］，因而得以廣泛研究，大多數(shù)研究主要涉及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6高表達(dá)已經(jīng)在許多其它人的腫瘤和鼠的腫瘤模型中被鑒定。HDAC6在卵巢癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平顯著高于良性組織和卵巢正常上皮細(xì)胞［12］。Sakuma等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6在原發(fā)性的口腔鱗癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與原發(fā)性的腫瘤分期密切相關(guān)。此外，在原發(fā)性的急性髓細(xì)胞樣白血病母細(xì)胞瘤和成髓細(xì)胞系中HDAC6表達(dá)上調(diào)。HDAC6在多種不同的腫瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)表明其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但尚未見關(guān)于HDAC6在宮頸癌中的研究報道，因此在本研究中，我們分析63例宮頸癌組織、38例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和63例正常宮頸上皮組織中 HDAC6蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，HDAC6蛋白在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和正常宮頸上皮組織中表達(dá)的陽性率分別為 80.95%、39.47%和11.11%，3組之間HDAC6蛋白的表達(dá)具有顯著差異(P＜0.05)，提示宮頸癌中高表達(dá)的HDAC6可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這一結(jié)果與HDAC6在其它腫瘤中的表達(dá)具有明顯的一致性［17-18］。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)HDAC6蛋白的表達(dá)與宮頸癌患者的年齡和組織分化程度無關(guān)(P＞0.05)，但與臨床分期、浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均關(guān)系密切(P＜0.01或P＜0.05)。利用免疫組織化學(xué)了解HDAC6蛋白的表達(dá)和定位后，我們采用更為靈敏的Western blotting進(jìn)一步證實宮頸癌組織中HDAC6蛋白的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中HDAC6蛋白的表達(dá)均顯著高于其相對應(yīng)的正常宮頸上皮組織，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。更為重要的是，我們在采用Western blotting檢測3號樣品正常宮頸上皮組織時未發(fā)現(xiàn)HDAC6蛋白的表達(dá)，這一結(jié)果從某種程度上來說進(jìn)一步驗證了免疫組織化學(xué)結(jié)果的可靠性。

總之，我們的研究表明，宮頸癌組織中存在高水平的HDAC6，其高表達(dá)與腫瘤的臨床分期、浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是其相關(guān)的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探討，進(jìn)一步的研究有望為以HDAC6為靶點的宮頸癌基因治療提供新的理論依據(jù)。

［1］ Mu?oz N，Bosch FX，de Sanjosé S，et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer［J］.N Engl J Med，2003，348(6): 518-527.

［2］ Matsukura T，Sugase M.Pitfalls in the epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer using polymerase chain reaction:driver and passenger［J］.Int J Gynecol Cancer，2008，18(5): 1042-1050.

［3］ zur Hausen H.Papillomaviruses in the causation of human cancers:a brief historical account［J］.Virology，2009，384(2):260－265.

［4］ Beaudenon S，Huibregtse JM.HPV E6，E6AP and cervical cancer［J］.BMC Biochem，2008，9(Suppl 1):S4.

［5］ Thomison J 3rd，Thomas LK，Shroyer KR.Human papillomavirus:molecular and cytologic/histologic aspects related to cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma［J］.Hum Pathol，2008，39(2):154－166.

［6］ Grozinger CM，Hassig CA，Schreiber SL.Three proteins define a class of human histone deacetylases related to yeast Hda1p［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96 (9):4868－4873.

［7］ Verdel A，Khochbin S.Identification of a new family of higher eukaryotic histone deacetylases.Coordinate expression of differentiation－dependent chromatin modifiers［J］.J Biol Chem，1999，274(4):2440－2445.

［8］ Verdel A，Curtet S，Brocard MP，et al.Active maintenance of mHDA2/mHDAC6 histone－deacetylase in the cytoplasm［J］.Curr Biol，2000，10(12):747－749.

［9］ Zhang Y，Gilquin B，Khochbin S，et al.Two catalytic domains are required for protein deacetylation［J］.J Biol Chem，2006，281(5):2401－2404.

［10］ Zhang Y，Li N，Caron C，et al.HDAC－6 interacts with and deacetylates tubulin and microtubules in vivo［J］.EMBO J，2003，22(5):1168－1179.

［11］ Zhang Z，Yamashita H，Toyama T，et al.HDAC6 expression is correlated with better survival in breast cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10(20):6962－6968.

［12］ Bazzaro M，Lin Z，Santillan A，et al.Ubiquitin proteasome system stress underlies synergistic killing of ovarian cancer cells by bortezomib and a novel HDAC6 inhibitor［J］.Clin Cancer Res，2008，14(22):7340－7347.

［13］ Sakuma T，Uzawa K，Onda T，et al.Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma［J］.Int J Oncol，2006，29(1):117－124.

［14］ Park SW，Kim HS，Yoo NJ，et al.Mutational analysis of mononucleotide repeats in HDAC4，5，6，7，9 and 11 genes in gastric and colorectal carcinomas with microsatellite instability［J］.Acta Oncol，2011，50(2):317－318.

［15］ Kuester D，Dar AA，Moskaluk CC，et al.Early involvement of death－associated protein kinase promoter hypermethylation in the carcinogenesis of Barrett's esophageal adenocarcinoma and its association with clinical progression［J］.Neoplasia，2007，9(3):236－245.

［16］ Aldana－Masangkay GI，Sakamoto KM.The role of HDAC6 in cancer［J］.J Biomed Biotechnol，2011，2011:875824.

［17］ Skov V，Larsen TS，Thomassen M，et al.Increased gene expression of histone deacetylases in patients with Philadelphia－negative chronic myeloproliferative neoplasms［J］.Leuk Lymphoma，2012，53(1):123－129.

［18］ Wang KH，KaoAP，ChangCC，etal.Increasing CD44+/CD24－tumor stem cells，and upregulation of COX－2 and HDAC6，as major functions of HER2 in breast tumorigenesis［J］.Mol Cancer，2010，9:288.