腦卒中患者CX37基因I1297D多態(tài)性研究

劉 丹，王貴喜，連 瑜，賈 璐，張廣煒，宋瑞琪，張 佳，孫 量

(包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014010)

在腦卒中發(fā)病機制的探討中，人們已逐漸認識到，遺傳因素在其發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用。研究顯示，連接蛋白(CX37)基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化形成和進展、急性心肌梗死、冠心病發(fā)病密切相關［1～10］，而腦卒中也是在動脈粥樣硬化基礎上形成和發(fā)展的，那么CX37基因多態(tài)性與腦卒中是否相關?因此，本研究擬從基因遺傳學角度入手，探討CX37基因I1297D多態(tài)性與缺血性腦卒中和出血性腦卒中的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年7月～2010年10月在我科連續(xù)住院的急性腦卒中患者348例作為腦卒中組，其中男217例、女131例，年齡(61.02± 12.47)歲，其中包括出血性卒中患者116例(腦出血組)和缺血性卒中患者232例(腦缺血組)。依據(jù)1990年我國腦血管病分類標準，又將腦缺血組分為腦梗死組115例、腦栓塞組31例、腔隙性腦梗死組(腔梗組)86例，均符合全國第四屆腦血管病學術會議通過的診斷標準，并經(jīng)頭顱CT或MRI檢查證實。排除標準:嚴重感染、惡性腫瘤、結締組織病以及1 a內(nèi)患組織損傷疾病如心肌梗死，重大外科手術、接受免疫抑制劑治療者及同時患缺血性腦卒中和出血性腦卒中者。同期選擇我院體檢中心的無腦卒中病史的體檢者235例作為對照組，其中男146例、女89例，年齡(60.86±9.92)歲。兩組年齡、性別相匹配，具有可比性。所有入組者知情同意，為包頭市長住居民、漢族、彼此無親緣關系。

1.2 調(diào)查和記錄方法 詳細詢問并記錄入選者的一般情況(包括姓名、性別、年齡、職業(yè)、民族、住院號、地址、聯(lián)系電話等);既往情況(既往病史及健康狀況、吸煙飲酒史);住院情況(包括入院日期、入院NIHSS評分、GCS評分、實驗室血液學檢驗值、頭顱影像結果、出院日期、并發(fā)癥等);隨訪情況(生存狀況、復發(fā)、治療和康復情況以及預后評估量表Barthel Index)。

1.3 限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析技術判定基因型 抽取患者晨空腹靜脈血2 mL，置EDTANa2抗凝管中-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用北京天根公司血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用PCR檢測，PCR引物序列參照文獻設計，由上海生工合成。連接蛋白37基因I1297D基因擴增引物序列為:上游引物5'-GGAGCCTCATTGCAAGTTGT-3'，下游引物5'-TGACTGTTCCATAGGGTGAG-3'，擴增產(chǎn)物為214 bp;反應體系為25 μL，其中模板DNA 100 ng，10×buffer 5 μL，dDNPs 1 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U和上下游引物各2 μL;反應條件為:94℃預變性5 min，然后94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物(圖1)經(jīng)HinfⅠ限制性內(nèi)切酶與37℃消化過夜后，進行3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后分析基因型。

圖1 CX37 I1297D PCR產(chǎn)物電泳圖

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用s表示，用基因計數(shù)法計算單個基因型和等位基因頻率，不同基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗，以P≤0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 一般資料比較 與對照組比較，腦卒中組患者收縮壓、舒張壓和甘油三酯水平明顯升高(P＜0.05)，有吸煙史比例明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 腦卒中組和對照組一般資料比較

2.2 基因型鑒定 CX37 I1297D的DD型不含酶切位點的AG缺失型酶切產(chǎn)物為214 bp;II型含有酶切位點的AG純合型，酶切產(chǎn)物為111 bp和103 bp;ID型為雜合型，酶切產(chǎn)物為214 bp、111 bp、103 bp。由于酶切后產(chǎn)生的111 bp合103 bp兩條帶相距較近，電泳結果顯示為一條帶(圖2)。

圖2 PCR-HinfⅠ酶切的CX37 I1297D

2.3 不同腦卒中類型與對照組基因型和等位基因頻率比較 腦卒中組和對照組人群CX37 I1297D多態(tài)性基因型分布均處于Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)，具有群體代表性。兩組人群CX37 I1297D基因型都出現(xiàn)三種，分別為II、ID、DD型，以II型為主。CX37基因I1297D的基因型和等位基因頻率分布在腦出血組、腦缺血組及其各亞組和對照組之間比較，均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，見表2。

3 討論

組成縫隙連接的蛋白亞單位稱為縫隙連接蛋白，本質為一組蛋白質，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20種以上。通過連接蛋白，相鄰細胞間可以形成細胞間通道，即縫隙連接［11］。相鄰細胞通過間隙連接進行信息和物質能量的交換，對于細胞的新陳代謝及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等生理過程起著重要調(diào)控作用。一些連接蛋白廣泛表達于各組織中，而另一些則較為嚴格地表達于特定組織中，并在那里發(fā)揮重要作用。CX37就屬于后者，被發(fā)現(xiàn)在脈管系統(tǒng)(如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞)和炎癥細胞中(如單核細胞、巨噬細胞)。近年研究發(fā)現(xiàn)CX37在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中具有一定意義;在腦缺血損傷研究中，急性腦缺血后縫隙連接活動增強并參與腦缺血損傷，預先給予連接蛋白阻斷劑后，平均梗死面積較對照組明顯減少［12］;在蛛網(wǎng)膜下腔出血的模型研究中發(fā)現(xiàn)連接蛋白的表達水平上調(diào)與腦血管痙攣程度呈正相關［13］。CX37基因位于人類染色體1p35.1，全長2 727 bp，由兩個外顯子和一個內(nèi)含子構成，編碼333個氨基酸。大量研究發(fā)現(xiàn)CX37基因多態(tài)性與頸動脈粥樣硬化形成、急性心肌梗死、冠心病發(fā)病有關。所有這些研究表明連接蛋白參與了多種心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，并在其中起到了重要的作用。但關于CX37基因多態(tài)性與腦血管病的研究未見報道。

表2 不同腦卒中類型與對照組CX37 I1297D的基因型和等位基因頻率比較［例(%)］

本研究采用RFLP分析技術檢測我國北方漢族人群CX37基因I1297D多態(tài)的分布并進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，我國北方漢族人群在該位點存在著AG堿基的插入/缺失多態(tài)性，CX37基因I1297D多態(tài)性分布以II型為主，DD基因型和D等位基因為少見型。I1297D基因型和等位基因分布頻率在腦出血組、腦缺血組和對照組間無統(tǒng)計學差異，而且，在缺血性腦卒中各亞組和對照組間亦無統(tǒng)計學差異，表明中國北方漢族人群的CX37 I1297D位點與腦卒中的發(fā)生無明顯相關性，提示CX37 I1297D多態(tài)性可能不是中國北方漢人群腦卒中發(fā)病的易感因素。另外，本研究中腦卒中組有吸煙史者比例及SBP、DBP、TG水平高于對照組，這與關于腦卒中發(fā)病機制及危險因素的大部分研究結果相符。

腦梗死發(fā)病機制復雜，是獲得性危險因素如生活方式、高血脂、高血壓、糖尿病等和種族、地域、環(huán)境、遺傳性危險因素如基因多態(tài)性等共同相互作用所致。我們的研究為腦卒中的分子和群體遺傳學研究提供了科學的實驗依據(jù)，為臨床防治心腦血管疾病開辟了新的思路。

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