水蛭素對(duì)增生性瘢痕基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9表達(dá)作用的影響

李開(kāi)通，劉達(dá)恩，陳小婷，魯海強(qiáng)，李順堂

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

當(dāng)皮膚損傷達(dá)到一定深度和范圍時(shí)，組織自然修復(fù)的結(jié)局便是瘢痕形成。皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程分為炎癥期、增生期、重塑期。在重塑期，填補(bǔ)組織缺損的肉芽組織逐漸發(fā)生纖維化，豐富的膠原沉積伴膠原構(gòu)型紊亂可導(dǎo)致增生性瘢痕形成。膠原本身是一種硬蛋白，無(wú)活動(dòng)能力，占體內(nèi)蛋白總量的25%，占皮膚干重的70%，是結(jié)締組織的主要成分。膠原的產(chǎn)生是創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程的高峰，也是瘢痕形成過(guò)程的決定性因素。膠原降解主要是膠原酶降解，研究證實(shí)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞膠原酶活性明顯低于正常成纖維細(xì)胞［1］。膠原酶家族中基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2，又稱(chēng)明膠酶A)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9，又稱(chēng)明膠酶B)逐漸成為研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要研究水蛭素對(duì)增生性瘢痕組織MMP-2、MMP-9表達(dá)的作用及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 臨床標(biāo)本來(lái)自2011年4～8月在我院燒傷整形科手術(shù)切除的增生性瘢痕組織，其中男7例、女5例。手術(shù)室切取增生性瘢痕組織標(biāo)本均取得患者或家屬同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 胎牛血清(FBS，杭州四季青生物公司);DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司);MMP-2、MMP-9酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海鑫樂(lè)生物科技有限公司);水蛭素(武漢圣天宇科技有限公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.3 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 成纖維細(xì)胞來(lái)自增生性瘢痕組織，采用組織塊法培養(yǎng)。將臨床標(biāo)本在無(wú)菌條件下清洗消毒后切成0.5～1 mm3的組織塊，種植于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2～4 h后輕輕翻轉(zhuǎn)，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)。每周換液2～3次，待原代細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底70%時(shí)消化傳代，本實(shí)驗(yàn)選用第4～5代細(xì)胞。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 分為4組:對(duì)照組(無(wú)水蛭素)，水蛭素0.5 U/mL組，水蛭素1 U/mL組，水蛭素2 U/ mL組。

1.5 水蛭素作用樣品提取 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化，不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液制成密度為2.5×104的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入0.5、1、2 U/mL的水蛭素藥液，對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)觀察48 h。收集培養(yǎng)液于無(wú)菌EP管中，2 000 r/min離心20 min，去除沉淀取上清液凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 ELISA法測(cè)定MMP-2、MMP-9的表達(dá) 采用雙抗體夾心ABC法。將120 μL的原倍標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋。標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL、鏈霉素-HRP 50 μL;空白孔中只加入顯色劑A和B及終止液;待測(cè)樣品孔中加入樣品40 μL，HRP標(biāo)記抗MMP-2、MMP-9抗體10 μL，鏈霉親和素-HRP 50 μL。37℃溫育60 min。洗滌拍干后加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，震蕩混勻，37℃避光反應(yīng)15 min。每孔加終止液50 μL終止反應(yīng)?？瞻卓渍{(diào)零，450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(OD)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MMP-2、MMP-9表達(dá)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)后第5～7天從組織塊爬出，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形，胞體飽滿(mǎn)，細(xì)胞排列呈一定弧度。水蛭素作用后細(xì)胞開(kāi)始變圓，細(xì)胞間隙增大，數(shù)量減少。

2.2 水蛭素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9的影響 水蛭素能夠升高M(jìn)MP-2、MMP-9的表達(dá)，0.5、1、2 U/mL水蛭素組中MMP-2、MMP-9含量均高于對(duì)照組，分別以0.5 U/mL組和1 U/mL組作用最明顯，但兩濃度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

3 討論

增生性瘢痕的形成是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，多種細(xì)胞因子參與其發(fā)生和發(fā)展，近年來(lái)研究多認(rèn)為其發(fā)生機(jī)理是成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖為主的細(xì)胞基質(zhì)降解失衡、過(guò)度沉積及細(xì)胞因子大量產(chǎn)生［2］，但血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖及新血管的形成等因素都影響著增生性瘢痕的形成［3］。保持基質(zhì)合成與降解之間的平衡對(duì)完成組織修復(fù)有重要作用，且細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解是組織修復(fù)和重建中的關(guān)鍵過(guò)程。而MMPs是細(xì)胞基質(zhì)降解的關(guān)鍵成分，尤其以MMP-2、MMP-9是膠原降解的關(guān)鍵酶［4］。MMP-2、MMP-9分別被稱(chēng)為72 kD-Ⅳ型膠原酶和92 kD-Ⅳ型膠原酶，共同作用底物是Ⅳ型膠原，但MMP-2作用更廣泛，還可以降解V、VII型膠原、彈性蛋白、纖維粘連蛋白及蛋白多糖中的蛋白核心。兩種MMPs主要由成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等合成和分泌，參與成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞等的遷移、分化及新生血管形成［5］。Oikarinen采用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)MMP-9主要表達(dá)于表皮細(xì)胞中，出現(xiàn)在創(chuàng)面愈合早期，參與創(chuàng)面愈合;MMP-2主要表達(dá)成纖維細(xì)胞中，出現(xiàn)在創(chuàng)面晚期，參與組織重塑。MMP-2和MMP-9可以分解多種基質(zhì)，還是腫瘤細(xì)胞侵襲性的標(biāo)志。

表1 水蛭素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響(ng/mL，s)

表1 水蛭素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響(ng/mL，s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與2 U/mL組比較，△P＜0.05

對(duì)照組15.179 9±12.863 9 9441.000 0±837.996 3水蛭素0.5 U/mL 55.915 3±12.005 5＊△ 11293.500 0±2593.8550＊△水蛭素1 U/mL 46.365 1±16.083 4＊△ 11709.000 0±461.827 3＊△水蛭素2 U/mL 39.793 7±4.000 3* 10367.000 0±663.429 6*

水蛭是一味傳統(tǒng)中藥，中醫(yī)用于治療血瘀經(jīng)閉和跌打損傷。水蛭素是醫(yī)用水蛭中分離純化的一種多肽，能夠與凝血酶活性位點(diǎn)結(jié)合，形成非共價(jià)復(fù)合物發(fā)揮抗凝作用，是目前已知的活性最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑。今年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)水蛭素有抑制增生的作用［6］。張博等［7］發(fā)現(xiàn)復(fù)方水蛭素對(duì)小鼠移植瘤有顯著抑制作用;楊影等［8］研究證實(shí)水蛭素對(duì)體外培養(yǎng)鞏膜成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)有抑制作用;李璇等［9］發(fā)現(xiàn)水蛭素能夠抑制成纖維細(xì)胞增殖，抑制I、Ⅲ型前膠原mRNA的表達(dá)。但關(guān)于水蛭素對(duì)成纖維細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9有何作用的報(bào)道較少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過(guò)體外培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)0.5、1、2 U/mL水蛭素能夠促進(jìn)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，二者表達(dá)含量上升，高于對(duì)照組。0.5 U/mL水蛭素對(duì)MMP-2作用最明顯，1 U/mL水蛭素對(duì)MMP-9作用最明顯。MMP-2、MMP-9是降解瘢痕組織中細(xì)胞外基質(zhì)的主要因素，加入水蛭素后MMP-2、MMP-9的表達(dá)含量增加，說(shuō)明水蛭素能夠促進(jìn)二者基因表達(dá)而發(fā)揮分解膠原的作用。水蛭素通過(guò)促進(jìn)MMPs表達(dá)減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積而減輕瘢痕增生和攣縮，有抑制瘢痕增生的作用。

細(xì)胞外基質(zhì)在創(chuàng)傷修復(fù)中具有重要作用，基質(zhì)代謝平衡失調(diào)與增生性瘢痕的形成有緊密關(guān)聯(lián)［10］，MMPs是起主要降解作用的膠原酶。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水蛭素能夠提高M(jìn)MP-2、MMP-9的表達(dá)減輕細(xì)胞基質(zhì)沉積，為進(jìn)一步研究水蛭素應(yīng)用治療增生性瘢痕機(jī)制提供了思路。MMP-2和MMP-9與其抑制因子在創(chuàng)面愈合轉(zhuǎn)歸中的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)，水蛭素對(duì)其抑制因子的作用需要進(jìn)一步研究。

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