曲古抑菌素A對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞株p53和p21表達(dá)的影響

劉 超，趙 頌，張秀梅，王翠瑤，劉 洋，肖建英

(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001)

組蛋白去乙?；敢种苿┑膽?yīng)用標(biāo)志著一種全新的腫瘤治療途徑。曲古抑菌素A(TSA)是一種高效、低毒的化療新藥，可通過多種途徑發(fā)揮其抗癌效應(yīng)，在體內(nèi)外可阻滯多種腫瘤細(xì)胞株的生長，誘導(dǎo)分化及凋亡，但抗腫瘤的具體機(jī)制尚不清楚［1～4］。2010年10月～2011年7月，本研究通過選用不同濃度的TSA作用于甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞株，旨在探討TSA對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞株生長增殖及細(xì)胞周期蛋白p53與p21表達(dá)的影響，進(jìn)而探討TSA的抗癌機(jī)制，為TSA的臨床開發(fā)應(yīng)用提供詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 TSA、L15培養(yǎng)液(Sigma公司);RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒(TaKaRa公司);p53(兔抗人多克隆抗體)、p21(小鼠抗人多克隆抗體)、β-Actin抗體(兔抗人多克隆抗體)購自Santacruz公司;Western細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司); ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Piece Biotechnology公司);四甲基氮唑蘭(Sigma公司);BB16UV CO2培養(yǎng)箱(Heraeus);Sunrise自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(Tecan公司); BioPhotometer Plus核酸蛋白測(cè)定儀、PCR擴(kuò)增儀購自Eppendorf公司;水浴式電轉(zhuǎn)印槽DYY-Ⅲ40B型(北京六一儀器廠)，凝膠自動(dòng)成像儀GDS8000、電泳儀、電泳槽(Bio-Rad，美國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所。培養(yǎng)基為L15，含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，在飽和濕度、37℃、無CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合至培養(yǎng)瓶底面積80%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，以1×105個(gè)/mL濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中或96孔培養(yǎng)板中。24 h后待細(xì)胞貼壁后給藥，TSA組終濃度分別為50、100、200、400 nmol/L，DMSO組加入5 μL DMSO［DMSO濃度小于0.1%(V/V)］，此濃度對(duì)細(xì)胞生長無影響。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長抑制率 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL接種于96孔板上，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的TSA，各濃度組6復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，加入20 uL MTT(5 mg/ mL)孵育4 h。棄去培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩15 min，使沉淀物充分溶解。用酶標(biāo)儀490 nm測(cè)吸光度值(A值)，測(cè)定細(xì)胞生長抑制率。公式如下:抑制率=1－加藥組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.4 RT-PCR方法檢測(cè)p53、p21 mRNA表達(dá) 采用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。用RNA PCR(AMV)Ver3.0試劑盒，按操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。反轉(zhuǎn)錄條件42℃，30 min;99℃，5 min;5℃5 min。PCR引物序列:p53(5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3'，5'-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3'，292 bp);p21(5'-GGATGTCCGTCAGAACCCA-3'，5'-CAGGTCCACATGGTCTTCC-3'，399 bp);β– actin (5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'，5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'，661 bp)。循環(huán)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃30 s; p53 55.3℃;p21 58.5℃ 30 s;72℃ 50 s;30個(gè)循環(huán);72℃終延伸10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，應(yīng)用EDAS290凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度測(cè)量。

1.5 Western blot方法檢測(cè)p53、p21的蛋白表達(dá)用蛋白裂解液提取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度，－20℃或－80℃保存?zhèn)溆谩ｋ娪厩?，加?×SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，之后用含5%BSA的TBS(pH 7.4)將濾膜于室溫?fù)u動(dòng)溫育2 h進(jìn)行封閉，封閉后的濾膜再分別與p53、p21抗體(稀釋比為1∶200)、β-actin(稀釋比為1∶1 000)4℃溫育過夜。經(jīng)TTBS洗滌后，HRP偶聯(lián)的IgG作為二抗(稀釋比為1∶5 000)室溫溫育2 h，洗膜后，使用ECL發(fā)光法顯色。內(nèi)參采用β-actin。計(jì)算機(jī)軟件Image J進(jìn)行密度分析，計(jì)算灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)以s表示，多樣本均數(shù)檢驗(yàn)采用方差分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長抑制率檢測(cè)結(jié)果 SW579細(xì)胞經(jīng)不同濃度TSA(0、50、100、200、400 nmol/L)分別作用下，各組細(xì)胞抑制率隨著藥物濃度的升高而升高(P＜0.01)，分別為0、23.58%、32.39%、42.83%、74.03%，說明TSA各濃度組均可抑制細(xì)胞生長，且呈劑量依賴性。

2.2 RT-PCR結(jié)果 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳灰度測(cè)量分析表明，未加TSA組p53(0.190±0.002)，p21(0.239±0.004)表達(dá)量較低。DMSO組p53 (0.216±0.001)，p21(0.203±0.003)與未加TSA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與未加TSA組比較，TSA在(50～400 nmol/L)濃度范圍內(nèi)p53的mRNA表達(dá)水平無明顯提高，分別為0.212±0.001、0.211 ±0.001、0.249±0.001和0.268±0.001，且各組間無顯著性差異(P＞0.05)。而在TSA各濃度組p21的mRNA表達(dá)水平顯著提高，且TSA在(50～400 nmol/L)濃度范圍內(nèi)灰度值分別為0.338±0.003、0.410±0.004、0.448±0.001和0.579±0.004，且有劑量依賴性。結(jié)果見圖1、2。

2.3 Western blot結(jié)果 蛋白定量分析表明，未加TSA組p53(0.055±0.004)，p21(0.287±0.004)表達(dá)量較低;與未加TSA組比較，TSA在(50～400 nmol/L)濃度范圍內(nèi)p53的蛋白表達(dá)水平明顯提高，分別為0.146±0.008、0.267±0.004、0.298± 0.007和0.518±0.008，各組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。而TSA各濃度組隨著TSA濃度的增加，p21蛋白表達(dá)量逐漸增多，且TSA在50～400 nmol/L濃度范圍內(nèi)灰度值分別為0.338±0.003、0.410±0.004、0.448±0.001和0.579±0.004，各組與未加TSA組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見圖3。

圖3 SW579細(xì)胞經(jīng)TSA處理后p53、p21蛋白的表達(dá)

3 討論

TSA，以前被鑒定是抗真菌藥物，抑制去乙?；傅幕钚?。組蛋白乙?；閷?dǎo)的轉(zhuǎn)錄有利于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合核DNA［5］，表明組蛋白去乙?；敢种苿┠軌虼龠M(jìn)p53依賴的下游基因Bax和p21waf1/Cip1的轉(zhuǎn)錄，結(jié)合p53基因轉(zhuǎn)移比單獨(dú)的p53基因轉(zhuǎn)移更能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)50～400 nmol/L的TSA作用48 h后，TSA對(duì)SW579細(xì)胞的增殖均有顯著的抑制作用，并呈劑量依賴效應(yīng)。p53基因是重要的抑癌基因，野生型p53是細(xì)胞生長重要的負(fù)調(diào)節(jié)基因，維持細(xì)胞正常分化，抑制細(xì)胞增殖及癌變，同時(shí)也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)DNA損傷或突變時(shí)，野生型p53積累，上調(diào)其下游p21靶基因表達(dá)［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TSA各濃度組作用SW579細(xì)胞之后，p53的mRNA水平變化不明顯，蛋白表達(dá)水平隨著濃度的增高顯著上調(diào)，p53的mRNA水平未呈現(xiàn)與其蛋白水平一致的變化趨勢(shì)，說明TSA可能通過調(diào)節(jié)p53的穩(wěn)定性發(fā)揮作用。Nakajima等［6］報(bào)道250 nmol/L TSA作用于乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231后對(duì)p53的mRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比無明顯差異。Sowa等［8］證明骨肉瘤細(xì)胞系MG63中TSA通過Sp1位點(diǎn)以p53非依賴的途徑誘導(dǎo)p21WAF1/CIP1的轉(zhuǎn)錄激活，這與Li等［4］得出的TSA處理HeLa細(xì)胞時(shí)p53的表達(dá)改變的結(jié)論有所不同，分析可能由于不同實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞株由于較長時(shí)間培養(yǎng)基因背景發(fā)生改變所致，原因有待進(jìn)一步分析。在何種情況下p53能夠被TSA誘導(dǎo)表達(dá)并激活參與下游分子活性的調(diào)節(jié)是我們下一步的研究內(nèi)容。

p21基因是p53基因的下游基因，在功能上繼承了p53基因的抑癌作用，因此，p21作為抑癌基因是細(xì)胞周期重要的調(diào)控因子［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TSA各濃度組作用SW579細(xì)胞之后，p21的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，且隨著TSA濃度的增大而增加，呈現(xiàn)劑量依賴性效應(yīng)。Greenberg等［10］研究表明，TSA能抑制甲狀腺癌ATC細(xì)胞株生長、促進(jìn)其凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G1和G2/M期，同時(shí)增加p21WAF1/CIP1及p27Kip1的表達(dá)，抑制Cyclins A、B的表達(dá)。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致，提示TSA抑制甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞增殖的作用與上調(diào)p21表達(dá)水平有關(guān)。因此我們的研究認(rèn)為TSA誘導(dǎo)內(nèi)源p53表達(dá)增加時(shí)，增加的p53極可能通過直接作用于p21 WAF1/CIP1啟動(dòng)子上其效應(yīng)元件而增強(qiáng)p21 WAF1/CIP1的表達(dá)，從而在TSA通過Sp1途徑誘導(dǎo)p21 WAF1/CIP1轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮協(xié)同作用，表明乙酰化修飾極可能是這些細(xì)胞系中p21 WAF1/CIP1表達(dá)沉默的分子基礎(chǔ)。關(guān)于TSA對(duì)SW579細(xì)胞株的詳細(xì)作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室仍在進(jìn)一步研究之中。

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