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    “采用雙末端大規(guī)模平行測(cè)序?qū)υ袐D尿液中的胎兒DNA 的高分辨率分析”點(diǎn)評(píng)

    2012-03-08 09:25:58鄭楓蕓
    關(guān)鍵詞:導(dǎo)尿管等位基因游離

    鄭楓蕓

    (復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,上海 200032)

    1 論文題目及原文摘要

    1.1 論文題目

    High Resolution Size Analysis of Fetal DNA in the Urine of Pregnant Women by Paired-End Massively Parallel Sequencing

    1.2 摘要

    BackgroundFetal DNA in maternal urine,if present,would be a valuable source of fetal genetic material for noninvasive prenatal diagnosis.However,the existence of fetal DNA in maternal urine has remained controversial.The issue is due to the lack of appropriate technology to robustly detect the potentially highly degraded fetal DNA in maternal urine.

    MethodologyWe have used massively parallel paired-end sequencing to investigate cell-free DNA molecules in maternal urine.Catheterized urine samples were collected from seven pregnant women during the third trimester of pregnancies. We detected fetal DNA by identifying sequenced reads that contained fetal-specific alleles of the single nucleotide polymorphisms.The sizes of individual urinary DNA fragments were deduced from the alignment positions of the paired reads. We measured the fractional fetal DNA concentration as well as the size distributions of fetal and maternal DNA in maternal urine.

    Principal FindingsCell-free fetal DNA was detected in five of the seven maternal urine samples, with the fractional fetal DNA concentrations ranged from 1.92% to 4.73%.Fetal DNA became undetectable in maternal urine after delivery.The total urinary cell-free DNA molecules were less intact when compared with plasma DNA.Urinary fetal DNA fragments were very short,and the most dominant fetal sequences were between 29bp and 45bp in length.

    ConclusionsWith the use of massively parallel sequencing,we have confirmed the existence of transrenal fetal DNA in maternal urine,and have shown that urinary fetal DNA was heavily degraded.

    2 論文核心內(nèi)容及點(diǎn)評(píng)

    傳統(tǒng)產(chǎn)前分子遺傳診斷主要采用侵入性取樣方法,如絨毛膜取樣、羊膜腔穿刺等,可能造成自然流產(chǎn)、胎兒損傷、羊水持續(xù)滲漏感染及栓塞等嚴(yán)重后果,非侵入性產(chǎn)前診斷是臨床運(yùn)用的新方向。

    香港中文大學(xué)的盧煜明教授是非侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)的首創(chuàng)者。早在1997年,他率先發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中存在游離的胎兒DNA,2010年開(kāi)發(fā)出一種新的非侵入性檢測(cè)技術(shù),即通過(guò)母親的血液樣本獲得胎兒的全基因組圖譜。他們采用雙末端大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(paired-end massively parallel sequencing)對(duì)血漿DNA 分子進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)比對(duì)尋找匹配的胎兒DNA 序列。

    大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù) (massively parallel sequencing,MPS)是基于Sanger測(cè)序的高通量基因測(cè)序新技術(shù),是目前三大主要的二代測(cè)序技術(shù)之一。構(gòu)建末端配對(duì)測(cè)序(paired-end sequencing)的DNA 文庫(kù),為基因組進(jìn)一步拼接提供定位信息。此技術(shù)因高準(zhǔn)確性、高靈敏度及運(yùn)行成本相對(duì)較低等優(yōu)勢(shì),被越來(lái)越多地應(yīng)用于基因組學(xué)研究中。

    今年,盧煜明教授的研究團(tuán)隊(duì)又運(yùn)用MPS 在另一種臨床上重要的體液—孕婦尿液中檢測(cè)游離的胎兒DNA。本研究結(jié)果發(fā)表在2012 年10 月的《Science Translational Medicine》上,第一作者是

    Nancy Bo Yin Tsui。

    孕婦的尿液中如果存在胎兒DNA,那么將成為非常寶貴的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷資源。然而,胎兒DNA是否存在孕婦尿液中一直存在爭(zhēng)議。問(wèn)題或許在于目前缺乏恰當(dāng)?shù)募夹g(shù)手段檢測(cè)存在于母親尿液中,可能大部分已降解的胎兒DNA。

    尿液中的游離DNA 主要有2個(gè)來(lái)源:尿道細(xì)胞降解的DNA和血漿透過(guò)腎臟濾過(guò)屏障排泄到尿液中的DNA。血漿中的胎兒DNA 在母體分娩后被迅速清除,半衰期為16分鐘,一種可能的機(jī)制是血漿中的胎兒DNA穿越腎臟屏障排泄到母親的尿液中。作者基于此假設(shè),采用MPS來(lái)精確測(cè)量母體尿液中胎兒DNA 分子的片段大小、濃度的高分辨率譜。

    他們分別收集了孕婦在分娩前用導(dǎo)尿管收集的尿液和自然排泄的尿液,并以1例男性和1例非孕女性的尿液為對(duì)照,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Leptin基因DNA 片段(LEP)的濃度,發(fā)現(xiàn)自然排泄的尿液中游離胎兒DNA 的濃度顯著高于導(dǎo)尿管收集的尿液(圖1)。

    圖1 導(dǎo)尿管收集的尿液和自然排泄的尿液中LEP 基因DNA 片段的濃度比較

    接著,作者通過(guò)特異的單核苷酸多態(tài)(SNP)等位基因序列來(lái)識(shí)別胎兒的DNA。主要原理是根據(jù)母親為純合子(AA)基因型而胎兒為雜合子(AB)的SNP進(jìn)行確定。計(jì)算胎兒特異的等位基因(B 等位基因)和與母體共享等位基因(A 等位基因)的數(shù)目,通過(guò)公式獲得胎兒DNA 占孕婦尿液的百分?jǐn)?shù)。7個(gè)尿樣中共檢測(cè)到5個(gè)樣本中含胎兒游離DNA,濃度范圍在1.92%~4.73%,分娩后的產(chǎn)婦尿中檢測(cè)不到胎兒游離DNA。

    研究者還測(cè)量了胎兒和母體DNA 在尿液中的大小分布。他們將匹配序列與人基因組參考序列(hg18)進(jìn)行位置比對(duì),推導(dǎo)每例尿液中的DNA 片段大小。尿液中胎兒游離DNA 分子的總體完整性低于血漿中的游離DNA(圖2),這些DNA 片段一般很短,大部分長(zhǎng)度在29~45bp之間。

    圖2 孕婦血漿與尿液DNA 片段分布比較

    雖然與血漿相比,孕婦尿液中胎兒DNA 片段更短,濃度和檢出率(71%)偏低,并且此研究局限于妊娠晚期,但這種摸索性的大膽嘗試,為產(chǎn)前診斷的方法學(xué)研究領(lǐng)域開(kāi)拓了新思路。如果今后能擴(kuò)大樣本量,進(jìn)行規(guī)模性、系統(tǒng)性的研究,則將能為臨床提供有意義的數(shù)據(jù)。相信在未來(lái)幾年,隨著先進(jìn)的技術(shù)手段的運(yùn)用,檢測(cè)胎兒DNA 進(jìn)行非侵入性產(chǎn)前診斷將在臨床上有更廣泛的應(yīng)用。

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