高效液相色譜法測(cè)定昆明山海棠片中雷公藤酯甲含量

(廣西壯族自治區(qū)百色食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 百色 533000)

昆明山海棠 Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch.是衛(wèi)矛科 Celastraceae雷公藤屬植物，所含生物堿類(包括雷公藤次堿、雷公藤春堿、雷公藤吉堿)、二萜類(主要成分是環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物如雷公藤內(nèi)酯、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤內(nèi)酯醇、雷公藤甲素)、三萜類(雷公藤酯甲、雷公藤酯乙、山海棠內(nèi)酯)及其他如β－谷甾醇葡萄糖苷、表兒茶素、對(duì)羥基苯甲酸等化學(xué)成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗生育等藥理活性，臨床常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、白血病、紅斑狼瘡等疾病[1]。昆明山海棠片為昆明山海棠經(jīng)加工制成的薄膜衣片或糖衣片，收載于2010年版《中國(guó)藥典(一部)》，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用回流提取測(cè)定總生物堿的含量[2]。近年來(lái)，采用高效液相色譜法測(cè)定昆明山海棠片中雷公藤甲素的含量已有報(bào)道[3]。本試驗(yàn)中建立了高效液相色譜法測(cè)定昆明山海棠片中雷公藤酯甲含量的方法，取得了良好的結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括G1322A在線脫氣、G1311A四元泵、G1314B VWD紫外檢測(cè)器、安捷倫化學(xué)工作站軟件;AND GR－202型電子天平。雷公藤酯甲對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111597－200301);昆明山海棠片(市售，均為糖衣片);甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Phenomenex GeminiC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液－乙腈(32∶68);流速1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按雷公藤酯甲峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。雷公藤酯甲峰保留時(shí)間為25.7 min，陰性對(duì)照品溶液不干擾測(cè)定，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取雷公藤酯甲對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含50 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取昆明山海棠片20片，除去包衣，研成細(xì)粉，精密稱取適量(相當(dāng)于2.5片)，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲提取30 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，即得供試品溶液。根據(jù)處方和工藝，照供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密稱取雷公藤酯甲對(duì)照品11.25 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含雷公藤酯甲 0.45 mg 的貯備液，精密量取貯備液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定。以峰面積 A對(duì)質(zhì)量濃度C(μg/mL)進(jìn)行回歸處理，回歸方程為 A=3.461 1 C+0.900，r=0.999 7(n=5)。結(jié)果表明，雷公藤酯甲質(zhì)量濃度在 18.0～90.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為54.0 μg/mL 的溶液，進(jìn)樣 10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果雷公藤酯甲峰面積的 RSD為0.36%(n=6)，表明進(jìn)樣精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品5份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，在擬訂的色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果雷公藤酯甲含量平均值為0.6%，RSD=0.91%(n=5)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果雷公藤酯甲峰面積的 RSD為0.62%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密稱定已測(cè)知含量的樣品(每片含雷公藤酯甲1.28 mg)粉末適量(相當(dāng)于1片)，共6份，置50 mL量瓶中，分別精密加入含雷公藤酯甲對(duì)照品溶液(濃度為0.505 5 g/L)1.0，2.5，4.0 mL，按供試品溶液制備方法制備待測(cè)溶液并依法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取昆明山海棠片20片，依法制備供試品溶液。取供試品溶液和對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=4)

3 討論

曾比較了無(wú)水乙醇和甲醇對(duì)昆明山海棠片中雷公藤酯甲的提取效率，結(jié)果二者所得峰面積相近、峰形良好，但以乙醇作供試品溶劑時(shí)，進(jìn)樣后會(huì)出現(xiàn)較大的前延峰，故采用甲醇提取。

超聲提取時(shí)間(15，30，60 min)的考察結(jié)果表明，用甲醇超聲提取30 min和60 min的含量相差不大，表明30 min超聲提取完全。因此，選擇以甲醇超聲提取樣品30 min。

昆明山海棠片的甲醇提取液呈棕紅色，所含成分較多，極性差別大，文獻(xiàn)[4]認(rèn)為直接進(jìn)樣會(huì)污染色譜柱，且分離效果差，故樣品預(yù)處理時(shí)都要過(guò)氧化鋁柱。本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[5]，創(chuàng)新地將昆明山海棠片樣品以甲醇提取后直接測(cè)定，在雷公藤酯甲質(zhì)量濃度為 18.0～90.0 μg/mL范圍內(nèi)采用 C18色譜柱，控制適宜的流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度，可使雷公藤酯甲較好地與其他成分分離，避免了提取過(guò)程中的損失，達(dá)到了簡(jiǎn)化操作的目的。

本試驗(yàn)測(cè)定了3個(gè)廠家的4批產(chǎn)品，結(jié)果表明，不同廠家生產(chǎn)的昆明山海棠片中雷公藤酯甲含量為0.78～1.28 mg，這可能是由所用的昆明山海棠藥材產(chǎn)地、采收期及生產(chǎn)工藝的差異造成。本法具有簡(jiǎn)便快速、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，可用于昆明山海棠片的質(zhì)量控制。

[1]王 鉞，隆長(zhǎng)鋒.中藥昆明山海棠的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2006，12(11):691－692.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:812－813.

[3]李勝容，王賢英.HPLC法測(cè)定昆明山海棠片中雷公藤甲素的含量[J].藥物分析雜志，2008，28(7):1 150－1 152.

[4]陳曉明.高效液相色譜法測(cè)定雷公藤飲片中雷公藤內(nèi)酯醇的含量[J].中國(guó)藥房，2006，17(9):696－697.

[5]黃秀旺，許建華，陳元仲.高效液相色譜法測(cè)定雷公藤片中雷公藤甲素含量的方法改進(jìn)[J].海峽藥學(xué)，2009，21(12):57－58.