表面展示雞傳染性支氣管炎病毒M 41株S1蛋白的重組假型桿狀病毒的構(gòu)建

陳筱薇，樊惠英，林文耀，程曉亮，葉 昱，陳春麗，2，廖 明

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642;2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安 625000)

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起雞的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病.本病于1931年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn).在我國(guó)，鄺榮祿于1972年在廣東首次發(fā)現(xiàn)后，北京、上海等地相繼有報(bào)道，目前已成為養(yǎng)雞業(yè)中危害最大的傳染病之一.IBV基因組編碼N、M、E和S 4種蛋白.其中S蛋白由S1和S2兩種糖多肽構(gòu)成，S1蛋白是IBV最重要的保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)血凝抑制抗體和大部分病毒中和抗體的產(chǎn)生，還可以在雞體內(nèi)誘導(dǎo)I特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，關(guān)于IBV基因工程疫苗的研究，基本集中在S1基因上［1-4］.在桿狀病毒表面展示系統(tǒng)中用于和外源蛋白發(fā)生融合的囊膜糖蛋白gp64，是出芽型病毒(Budded virus，BV)特有的結(jié)構(gòu)蛋白，由N末端信號(hào)肽和成熟蛋白(跨膜區(qū)TM和胞質(zhì)區(qū)CTD)組成［5］，介導(dǎo)病毒和昆蟲(chóng)細(xì)胞的融合及侵染過(guò)程.gp64被開(kāi)發(fā)成桿狀病毒表面展示系統(tǒng)來(lái)展示不同的目的蛋白，外源基因片段插入到病毒囊膜蛋白的信號(hào)肽與成熟蛋白之間，表達(dá)加工時(shí)信號(hào)肽被切除，形成的N端融合蛋白借助桿狀病毒穩(wěn)定地表達(dá)并展示于感染細(xì)胞或病毒粒子的表面，篩選得到表達(dá)有目的蛋白的重組桿狀病毒.目前，桿狀病毒表面展示系統(tǒng)已經(jīng)被開(kāi)發(fā)用于進(jìn)行基因工程亞單位疫苗的研制［6-7］.據(jù)此，本研究通過(guò)修飾外源基因，構(gòu)建表面展示傳染性支氣管炎病毒M41株S1蛋白的重組桿狀病毒，為傳染性支氣管炎病毒基因工程疫苗的研究提供新的選擇.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與細(xì)胞 IBV-M41毒株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存.Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞為GIBCO BRL公司產(chǎn)品.

1.1.2 菌種與質(zhì)粒 pFsatbacTMDual為GIBCO BRL公司產(chǎn)品，pBACsurf-1為美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品.大腸埃希菌DH5a、DH10Bac菌株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.3 主要試劑 ExTMTaq DNA多聚酶、dNTP，為大連寶生物工程公司產(chǎn)品，T4DNA連接酶和各種限制性內(nèi)切酶等工具酶均為NEB(NEW ENGLAND BioLabs)公司產(chǎn)品.DNA凝膠純化試劑盒為Promega公司產(chǎn)品.質(zhì)粒抽提試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品.昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基(Grace’s)和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品.胎牛血清為奧地利PAA公司產(chǎn)品，抗IBV M41 S1的單克隆小鼠腹水為上海艾比瑪生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pBACsurf-dS1的構(gòu)建 根據(jù)M41株序列設(shè)計(jì)合成1對(duì)擴(kuò)增S1基因的引物PS1、PS2，上下游引物引入相同的酶切位點(diǎn)XmaⅠ引物序列如下，由Invitrogen公司合成.

擴(kuò)增片段為1 542 bp，擴(kuò)增的片段不含有S1基因的信號(hào)肽(SP).回收PCR產(chǎn)物并用XmaⅠ酶切，并將其克隆到同樣用XmaⅠ酶切的表面展示載體pBACsurf-1，獲得重組質(zhì)粒pBACsurf-dS1.

1.2.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-gp64-dS1的構(gòu)建

以獲得的重組質(zhì)粒pBACsurf-dS1中g(shù)p4ss-dS1-gp64m序列，分別在上、下游引物的5'端引入限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、XbaⅠ，利用 PCR方法擴(kuò)增 gp4sshis-qS1-gp64m基因.

擴(kuò)增片段為3 129 bp.將PCR產(chǎn)物回收并用Eco-RⅠ、XbaⅠ雙酶切后，將其克隆到同樣用 Eco RⅠ、XbaⅠ雙酶切后的載體pFsatbacTMDual，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac-gp64-dS1(圖1).

圖1重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac-gp64-dS1Fig.1 Construction of recombinant donor plasmid pFastBacgp64-dS1

1.2.3 重組穿梭載體Bacmid-gp64-dS1的獲得 取2～5μL重組質(zhì)粒 pFastBac-gp64-dS1與100μL DH10Bac大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30 min后，于42℃ 45 s水浴進(jìn)行熱激，然后冰浴2 min，加入900μL LB液體培養(yǎng)基(高鹽)，37℃振搖培養(yǎng)4 h，按10-1、10-2、10-3稀釋細(xì)胞后，各取100 μL 涂布于三抗高鹽LB平板(Kan、Gen和Tet)，37℃培養(yǎng)24～48 h，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、純化白色陽(yáng)性菌落，提取重組Bacmid質(zhì)粒，以M13上下游引物進(jìn)行PCR鑒定.

1.2.4 重組桿狀病毒BV-dS1的獲得 提取純化Bacmid-gp64-dS1，利用脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，于28℃培養(yǎng)，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收集培養(yǎng)物上清液即獲得了重組桿狀病毒BV-dS1.

1.2.5 重組桿狀病毒BV-dS1感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d，將形態(tài)良好、生長(zhǎng)旺盛的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞以1×105孔-1的量接種到6孔板中，于37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層，去除培養(yǎng)基，將10μL重組桿狀病毒與1 mL昆蟲(chóng)細(xì)胞Grace’s培養(yǎng)液混和后，將此病毒感染液加入到Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中，28℃培養(yǎng)2 h后，棄去感染液，并用PBS洗1遍，加入2 mL新鮮培養(yǎng)基，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)60 h后，用PBS洗滌，甲醇固定細(xì)胞后，以鼠抗M41株S1抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn).

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pBACsurf-dS1的構(gòu)建

對(duì)重組質(zhì)粒pBACsurf-dS1進(jìn)行XmaⅠ酶切鑒定，酶切后產(chǎn)生大小約為9 400和1 500 bp的2個(gè)片段，與預(yù)期大小一致(圖2).在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)pBACsurf-dS1進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)無(wú)堿基突變.

2.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-gp64-dS1的構(gòu)建

對(duì)重組質(zhì)粒 pFastBac-gp64-dS1進(jìn)行 Eco RⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定，雙酶切后產(chǎn)生大小約為5 400和3 100 bp的2個(gè)片段，與預(yù)期大小一致(圖2).在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)pFastBac-gp64-dS1進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)無(wú)堿基突變.

2.3 重組穿梭載體Bacmid-gp64-dS1的PCR鑒定

將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-gp64-dS1轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)后，在含有三抗、IPTG和X-gal平板上進(jìn)行篩選，待出現(xiàn)藍(lán)白菌落后，挑選白色菌落，提取質(zhì)粒用M13上下游引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.01 g/mL的瓊脂糖凝膠電泳后，在5 400 bp處可見(jiàn)特異性條帶，證明gp4ss-his-qS1-gp64m基因與Bacmid已經(jīng)成功地發(fā)生了特異性位點(diǎn)轉(zhuǎn)座(圖3).

圖2 重組質(zhì)粒pBACsurf-dS1、pFastBac-gp64-dS1的酶切鑒定Fig.2 Identification of transfer vector pBACsurf-dS1and pFastBac-gp64-dS1

圖3 重組穿梭載體Bacmid-gp64-dS1的PCR鑒定Fig3 Identification of recombinant vector Bacmid-gp64-dS1 by PCR

2.4 重組桿狀病毒BV-dS1的獲得

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將提取的重組穿梭載體Bacmid-gp64-dS1轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，于28℃培養(yǎng)，待2～3 d后出現(xiàn)細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變大、變圓、膨脹、折光率增強(qiáng)等(圖4).

圖4重組桿狀病毒BV-dS1感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞Fig.4 Sf9 cells infected by the recombinant baculovirus BV-dS1

2.5 重組桿狀病毒BV-dS1的鑒定

重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞后，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn).結(jié)果表明，重組桿狀病毒BV-dS1毒感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞細(xì)胞膜上能產(chǎn)生特異性免疫熒光，而桿狀病毒野毒毒感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞未見(jiàn)任何特異熒光，表明重組桿狀病毒能夠在其感染的細(xì)胞表面表達(dá)S1蛋白(圖5).

圖5 BV-dS1感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞的間接免疫熒光試驗(yàn)Fig.5 Indirect immunofluoresent assay of Sf9 cells infected with BV-dS1 by IFA

3 討論

S蛋白是IBV最重要的保護(hù)性抗原，其作用表現(xiàn)為刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在病毒吸附細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用，在血清學(xué)分類上起決定性作用.S蛋白上存在8個(gè)抗原決定簇，其中S1上有6個(gè)，是重要的免疫原基因.S1蛋白在IBV最外層形成蘑菇狀的突起，膜定位信號(hào)為N端第1～18位氨基酸，S1蛋白近N端第37～81位，第117～160位，第269～298位氨基酸構(gòu)成了S1蛋白的抗原決定簇［8-9］，該定位區(qū)域缺失不會(huì)影響S1蛋白的免疫原性.

桿狀病毒是昆蟲(chóng)專一性的病原病毒，是目前為止發(fā)現(xiàn)最早、研究最多且實(shí)用意義很大的昆蟲(chóng)病毒，可作為一種新型的基因工程載體之一，具有目的基因容量大、蛋白表達(dá)效率高、翻譯后修飾系統(tǒng)、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，以它作為載體所開(kāi)展的基因工程疫苗方面的研究彰顯了其廣泛的應(yīng)用前景［10-12］.

桿狀病毒載體目前的主要應(yīng)用包括做為外源基因的轉(zhuǎn)移載體及表面展示外源基因的載體等.作為外源基因的轉(zhuǎn)移載體，桿狀病毒將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，使外源基因在其中瞬時(shí)高效表達(dá)［13-14］.因此，桿狀病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體，對(duì)于表達(dá)一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白或同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因，甚至攜帶整個(gè)病毒基因組，都體現(xiàn)了其他基因轉(zhuǎn)移載體難以比擬的優(yōu)勢(shì).但是，桿狀病毒不能在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，因此其在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)持續(xù)時(shí)間較短，所需的病毒量大，療效有限.桿狀病毒作為表面展示外源基因的載體，將外源蛋白或多肽與桿狀病毒的囊膜糖蛋白融合，使之在感染細(xì)胞的表面或病毒粒子的囊膜上獲得有效的展示.桿狀病毒表面展示系統(tǒng)除了具有桿狀病毒載體的一般優(yōu)點(diǎn)外，與亞單位疫苗比較，表達(dá)的蛋白在病毒表面，理論上能很好地刺激細(xì)胞免疫;而且使用純化的桿狀病毒可以減少佐劑生物用量，因?yàn)闂U狀病毒本身就可以作為佐劑刺激機(jī)體反應(yīng).目前，多種大分子的復(fù)雜真核蛋白已經(jīng)在桿狀病毒表面展示系統(tǒng)表達(dá)展示，在展示病毒蛋白方面，如SARS冠狀病毒表面S蛋白、柏格(氏)鼠瘧原蟲(chóng)環(huán)孢子蛋白，口蹄疫病毒A位點(diǎn)都被展示到桿狀病毒粒子表面，免疫動(dòng)物均能獲得理想的免疫原性［15-17］.另外，用桿狀病毒表面展示系統(tǒng)生產(chǎn)目的蛋白，純化過(guò)程特別簡(jiǎn)單，只需要超速離心得到重組桿狀病毒即可同時(shí)獲得目的蛋白，純化費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)單、可以規(guī)?；a(chǎn)，解決了目的蛋白純化代價(jià)昂貴、程序復(fù)雜的現(xiàn)狀［18］.

本研究獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-gp64-dS1后，再通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組將轉(zhuǎn)移載體上的外源基因整合到穿梭質(zhì)粒bacmid中，獲得重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞拯救出重組桿狀病毒，然后對(duì)重組桿狀病毒在實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)重組桿狀病毒的鑒定，證明了重組桿狀病毒BV-dS1的構(gòu)建成功.

本研究構(gòu)建了能表面展示雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白的重組假性桿狀病毒，為研制既具備能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及細(xì)胞免疫應(yīng)答的全病毒滅活疫苗的優(yōu)勢(shì)、又具備亞單位疫苗的安全性的雞傳染性支氣管炎的新型疫苗，提供一個(gè)可供選擇的新策略.

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【責(zé)任編輯 柴 焰】