當(dāng)歸內(nèi)生真菌抗植物病原菌的活性研究

江 曙， 段金廒， 錢大瑋， 陶金華

（1．南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210046； 2．南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南通 226019）

內(nèi)生真菌是指在植物體內(nèi)完成其生活史的部分或全部，生長(zhǎng)于植物組織細(xì)胞間，分布于葉鞘、種子、花、莖、葉片和根中，但又不引起任何病癥的微生物，突出強(qiáng)調(diào)了內(nèi)生真菌與植物的互惠共生關(guān)系［1］。Selosse等研究表明，被內(nèi)生真菌感染的植物遭受到真菌病害影響的程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于沒(méi)有感染內(nèi)生真菌的植物［2］。由此可見(jiàn)，內(nèi)生真菌可提高宿主植物對(duì)生物脅迫的抵抗能力［3］。

近年來(lái)的研究表明，內(nèi)生真菌是一個(gè)多樣性十分豐富的微生物類群，能夠產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)新穎、類型多樣的次生代謝產(chǎn)物，如萜類、生物堿類、芳香類、肽類等化合物，具有較強(qiáng)的抑菌、殺菌活性［4－6］，是臨床抗菌藥物和生物農(nóng)藥研究與開(kāi)發(fā)的潛在資源，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。目前關(guān)于藥用植物內(nèi)生真菌抗菌活性的研究較少，當(dāng)歸內(nèi)生真菌的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本文主要研究當(dāng)歸內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的抗菌活性，為進(jìn)一步尋找天然活性物質(zhì)及生物農(nóng)藥提供依據(jù)，為植物病原真菌的生物防治以及發(fā)展綠色中藥材探索新的途徑。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 供試菌株

當(dāng)歸內(nèi)生真菌（分離自當(dāng)歸新鮮植株），小麥赤霉病菌（Fusariu m gr a minear u m Sch w．），番茄早疫病菌（Alter naria sol ani），番茄灰霉病菌（Botr ytis cinerea），水稻紋枯病菌（Rhizoctonia sol ani），南京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥教研室保藏。

1．1．2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基［7］；內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1%，黃豆餅粉2%，淀粉1%，MySO4·7 H2O 0．3%，KH2PO40．3%，NH4Cl 0．3%，自然p H，121℃滅菌30 min。

1．1．3 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)（TGL－6B，上海安亭科學(xué)儀器廠），微量移液器（QYQ，北京金花），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE－52A，上海亞榮生化儀器廠）。

1．2 方法

1．2．1 內(nèi)生真菌的活化

將4℃冰箱中保藏的內(nèi)生真菌接種到新鮮的PDA斜面上，于28℃培養(yǎng)6～7 d。

1．2．2 內(nèi)生真菌的發(fā)酵及樣品處理

分別挑取內(nèi)生真菌菌塊接種到含有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，于28℃，200 r／min培養(yǎng)5 d。發(fā)酵結(jié)束后，10 000 r／min離心10 min，上清液于60℃減壓濃縮至4．0 mL，經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，得無(wú)菌濃縮液。

1．2．3 抗植物病原真菌活性的測(cè)定［8－9］

1．2．3．1 拮抗試驗(yàn)

挑取直徑為6 mm的小塊植物病原真菌接種于PDA平板的中央，然后將不同的內(nèi)生真菌（直徑6 mm）接種在平板四周，于28℃培養(yǎng)6 d，根據(jù)抑菌圈的有無(wú)及大小判斷是否存在拮抗作用以及拮抗作用的強(qiáng)弱。

1．2．3．2 抑制菌絲生長(zhǎng)法

將無(wú)菌濃縮液1 mL與9 mL融化的PDA培養(yǎng)基混勻，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中制成帶藥培養(yǎng)基平板。培養(yǎng)基凝固后，放入1個(gè)供試菌的菌餅（直徑為6 mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，重復(fù)3次。對(duì)照為取1 mL的無(wú)菌水與9 mL融化的PDA培養(yǎng)基混勻，其他操作同處理組一致。培養(yǎng)72～96 h后，按下列公式計(jì)算抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）／（對(duì)照菌落直徑－6）×100%。

1．2．3．3 抑制孢子萌發(fā)法

取供試植物病原真菌的孢子配成適當(dāng)濃度的孢子懸浮液，在10×10低倍鏡觀察，每個(gè)視野有30～40個(gè)孢子。將1 mL無(wú)菌濃縮液與1 mL孢子懸浮液混合，取1滴滴加在凹玻片上，每處理重復(fù)3次。對(duì)照為將1 mL的無(wú)菌水與1 mL孢子懸浮液混合，其他操作同處理組一致。在25℃下保濕培養(yǎng)，當(dāng)對(duì)照的萌發(fā)率達(dá)到80%后，檢查所有處理的萌發(fā)率。以孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子短半徑者為萌發(fā)。在小麥赤霉病菌孢子液中添加當(dāng)歸內(nèi)生真菌提取物后，培養(yǎng)至8 h，而其他3種病原真菌孢子的處理組均培養(yǎng)至10 h后，按下式計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率：

萌發(fā)抑制率＝（對(duì)照萌發(fā)率－處理萌發(fā)率）／對(duì)照萌發(fā)率×100%。

2 結(jié)果與分析

2．1 拮抗菌株的初步篩選

將分離于當(dāng)歸新鮮植株的206株內(nèi)生真菌分別進(jìn)行對(duì)小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌和水稻紋枯病菌的拮抗試驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)歸內(nèi)生真菌對(duì)小麥赤霉病菌和番茄早疫病菌的拮抗作用較為普遍，具有拮抗作用的內(nèi)生真菌比例分別達(dá)到24．3%和28．6%（表1）。

表1 當(dāng)歸內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌的拮抗作用

2．2 當(dāng)歸內(nèi)生真菌代謝物對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的抑制作用

采用菌絲生長(zhǎng)速率法考察了部分有益內(nèi)生真菌代謝物對(duì)4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，內(nèi)生真菌 Coccosporell a sp．、Coniosporieae sp．1、Fusell a sp．2和Fusell a sp．3代謝物對(duì)小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻紋枯病菌生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，抑制率分別達(dá)到71．6%、62．8%、76．6%和60．7%；此外，Phacidium sp．代謝物對(duì)小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌以及番茄灰霉病菌均具有較強(qiáng)的抑制活性，F(xiàn)usell a sp．2代謝物對(duì)番茄灰霉病菌和小麥赤霉病菌具有較強(qiáng)的抑制作用（表2）。

采用孢子萌發(fā)法考察了當(dāng)歸內(nèi)生真菌代謝物對(duì)4種植物病原真菌孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，對(duì)小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻紋枯病菌孢子萌發(fā)具有抑制作用的內(nèi)生真菌比例均超過(guò)20%（表3）。其中，以小黏盤孢屬（Myxor mia）、暗梗梭孢霉屬（Coniosporieae）以及束絲孢屬（Ozoniu m）的內(nèi)生真菌數(shù)量較多。My xor mia sp．2和My xor mia sp．4代謝物對(duì)4種植物病原真菌孢子萌發(fā)的抑制率均達(dá)到90%以上，Coniosporieae sp．4、Coniosporieae sp．6 以及 My xor mia sp．7代謝物對(duì)小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌孢子萌發(fā)抑制作用較強(qiáng)，Coniosporieae sp．7代謝物對(duì)小麥赤霉病菌和番茄早疫病菌孢子萌發(fā)的抑制活性約為其他2種植物病原菌的一倍（表4）。

表3 抑制4種植物病原真菌孢子萌發(fā)的當(dāng)歸內(nèi)生真菌的篩選

表4 當(dāng)歸有益內(nèi)生真菌代謝物對(duì)植物病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用

2．3 部分有益內(nèi)生真菌發(fā)酵液活性部位的篩選

將發(fā)酵液經(jīng)過(guò)低溫真空濃縮至干，得到的干物質(zhì)分別采用不同極性的溶劑（石油醚、乙酸乙酯、50%乙醇、水）進(jìn)行提取，提取液濃縮至干，進(jìn)行活性檢測(cè)。結(jié)果表明，乙酸乙酯提取部位對(duì)植物病原真菌菌絲體和孢子萌發(fā)的抑制作用相對(duì)較強(qiáng)，表明在內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物中非極性、親酯性的活性物質(zhì)含量較多，但不同的提取部位對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的整體抑制活性則大大減弱（表5，表6）。

表5 部分有益內(nèi)生真菌發(fā)酵液不同提取部位對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

表6 部分有益內(nèi)生真菌發(fā)酵液不同提取部位對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用

3 討論

在內(nèi)生真菌與宿主植物構(gòu)成的微生態(tài)系統(tǒng)中，內(nèi)生真菌發(fā)揮著重要的生態(tài)學(xué)功能，對(duì)植物病原菌的抑菌、殺菌現(xiàn)象較為普遍［10－11］。80%的植物內(nèi)生真菌在抗真菌、抗藻類或抗雜草等方面具有較強(qiáng)的生物活性，而來(lái)自土壤中的真菌大約只有43%具有活性［12］。其抗菌活性主要是由于能夠產(chǎn)生多種多樣的抗菌物質(zhì)，一些內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物堿可增強(qiáng)宿主植物的抗病性，抑制病原菌的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)等［13］。如從衛(wèi)矛科藥用植物雷公藤（Tripter ygeu m wil for dii Hook F．）中分離的內(nèi)生菌能產(chǎn)生一種新酰胺生物堿，該物質(zhì)對(duì)稻瘟病菌（Pyricul aria or yzae Cav．）及其他多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑殺作用［14－15］。從 美 麗 決 明（Cassia spectabilis）的擬莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌Phomopsis cassiae中分離到5個(gè)杜松烷倍半萜，其中3，11，12－trihydroxycadalene對(duì)球孢枝孢（Cladosporium sphaerosper mum）和枝狀枝 孢 （C．cl adosporioides）的 抑 菌 活 性 最 強(qiáng)［16］。由此可見(jiàn)，在尋找新的天然藥物以及植物病蟲害的防治藥物方面，植物內(nèi)生真菌將是一個(gè)新的資源庫(kù)。在本研究中，多數(shù)當(dāng)歸內(nèi)生真菌對(duì)小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻紋枯病菌等植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制活性，用不同極性溶劑進(jìn)行內(nèi)生真菌次生代謝物質(zhì)的提取，結(jié)果表明內(nèi)生真菌的活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯提取部位。此外，雖然不同提取部位的活性出現(xiàn)了不同程度的降低，但不同提取部位都具有一定的抗菌和抑制植物病原真菌孢子萌發(fā)的活性。本研究表明抗植物病原真菌的當(dāng)歸內(nèi)生真菌種群具有多樣性，同時(shí)其產(chǎn)生的活性物質(zhì)也具有多樣性的特點(diǎn)，因此藥用植物內(nèi)生真菌有望成為生物農(nóng)藥研究與開(kāi)發(fā)的新資源，在植物病蟲害生物防治中將具有較好的應(yīng)用前景，對(duì)于中藥材的栽培生產(chǎn)以及中藥資源可持續(xù)利用等方面都具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義和理論價(jià)值。

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