利用蠶豆根尖微核試驗研究入侵植物勝紅薊的化感作用潛力

吳亞娟， 何興金

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610064）

勝紅薊（Ager atu m conyzoides Linn．）為菊科勝紅薊屬（Ager atum）一年生草本植物，原產(chǎn)中南美洲，作為花卉被引入我國，19世紀(jì)末在云南南部發(fā)現(xiàn)。但由于多年來勝紅薊在控制柑橘園害螨的發(fā)生、涵養(yǎng)果園土壤水分、抗旱保墑、改善果園生態(tài)環(huán)境、增加果園綠肥等方面發(fā)揮了較為重要的作用［1］，因此被大量栽植，現(xiàn)已逃逸成為一種惡性入侵雜草。目前，勝紅薊在我國廣泛分布于長江以南地區(qū)，特別是廣東、廣西、福建、香港、云南及海南島等地生長最多［2］。勝紅薊生長迅速，繁殖力強(qiáng)，有強(qiáng)烈趨肥趨濕性，能迅速搶占空間，抑制周圍生境中植物的生長和繁殖，從而形成單一優(yōu)勢群落［3］。入侵后嚴(yán)重破壞當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境，對我國的生態(tài)安全造成了巨大威脅。

研究表明勝紅薊之所以能成功入侵并形成危害，是因為其植物體具有化感物質(zhì)，對生境中植物產(chǎn)生化感作用。目前，勝紅薊化感作用的研究方法主要是測定地上部分對不同受體種子萌發(fā)及生長發(fā)育的影響［4－6］，但由于研究者采用的受試植物品種、處理時間、培養(yǎng)方式等因素不同，容易導(dǎo)致試驗結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，本文以蠶豆為供試材料，對勝紅薊葉、莖、花不同部位及植物體地上部分的化感作用潛力進(jìn)行研究，以揭示勝紅薊植株不同部位的化感物質(zhì)對其生境中植物的影響，進(jìn)而揭示勝紅薊的入侵機(jī)理，以達(dá)到有效控制和合理利用。蠶豆根尖微核試驗（the micr onucleus test，MNT）是一種以染色體損傷及紡錘體毒性等為檢測指標(biāo)的植物遺傳毒性方法，是世界范圍內(nèi)推廣運(yùn)用的環(huán)境致突變性檢測技術(shù)［7］，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于對水體污染物、空氣污染物、農(nóng)藥、重金屬、化妝品、工業(yè)化學(xué)品等的致突變性檢測方面［8］。據(jù)報道已有研究將蠶豆根尖細(xì)胞微核作為檢測入侵植物化感物質(zhì)毒性的途徑之一［9－12］。本文利用蠶豆根尖微核試驗來研究勝紅薊葉、莖、花不同部位及地上部分的化感作用潛力并比較了不同部位的化感作用潛力的強(qiáng)弱，結(jié)果表明勝紅薊水浸液能夠引起蠶豆細(xì)胞產(chǎn)生微核及其致畸效應(yīng)，葉片具有最高的化感作用潛力，從而為勝紅薊的入侵機(jī)理和對其防治提供重要基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1．1 材料

受體植物：成都當(dāng)?shù)厥惺垡荒晷路N蠶豆，實驗室內(nèi)萌發(fā)備用。

供體植物：勝紅薊于2009年7月采集于成都市龍泉地區(qū)，采樣為當(dāng)年新生植株。

1．2 試驗方法

1．2．1 水浸提液的制備

將采集的勝紅薊植株地上部分洗凈，晾干表面水分后剪成長1．0～1．5 c m的斷片。按1∶10加入蒸餾水充分搖勻浸泡48 h，紗布過濾后得到質(zhì)量濃度0．100 0 g／mL的水浸提液原液（每毫升鮮質(zhì)量），4℃冷藏備用。

1．2．2 蠶豆根尖微核試驗

選擇飽滿、大小均勻的蠶豆種子在蒸餾水中浸泡24 h，置入具有紗布的培養(yǎng)皿中室溫培養(yǎng)2～3 d，每24 h用水沖洗1次，換水培養(yǎng)。選擇根長約1．0～1．5 c m整齊一致的蠶豆隨機(jī)分組，放入大小相同的培養(yǎng)皿中，每皿13顆，加入25 mL不同濃度（分別為0．005 0、0．007 5、0．010 0、0．025 0 g／mL，蒸餾水為對照）的地上部分、葉、莖以及花水浸提液，處理24 h，每處理重復(fù)3次，恢復(fù)培養(yǎng)24 h。于上午09：00切下1 c m左右根尖，卡諾氏固定液（無水乙醇∶冰乙酸＝3∶1）固定24 h。轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中4℃保存。

常規(guī)制片參照楊昌鳳，涂傳馨的方法［13］。用1 mol／L鹽酸∶45%冰乙酸＝2∶1混合液解離10～15 min，石炭酸品紅染液染色，壓片鏡檢。每個處理觀察10個根尖，每個根尖觀察1 000個細(xì)胞，記錄分生區(qū)細(xì)胞總數(shù)和分裂期的細(xì)胞數(shù)以及帶有微核的細(xì)胞數(shù)。Oly mpus BH－2光鏡觀察拍照。計算細(xì)胞有絲分裂指數(shù)（MI／%）、微核千分率（MCN／‰）（為便于統(tǒng)計分析，將鏡檢中間期微核和分裂期中類微核都統(tǒng)計為微核）以及染色體畸變率（CAF%）。

有絲分裂指數(shù)（MI）＝（進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)／所有觀察的細(xì)胞總數(shù)）×100%；

微核千分率（MCN）＝（具有微核的細(xì)胞數(shù)／所有觀察的細(xì)胞總數(shù)）×1 000‰；

染色體畸變率（CAF）＝（染色體畸變細(xì)胞數(shù)／所有觀察的細(xì)胞總數(shù)）×100%；

化感效應(yīng)敏感指數(shù)（RI）計算方法參照Willia mson［14］等的方法：RI＝1－C／T；

式中，C分別為有絲分裂指數(shù)、微核率、染色體畸變率對照值，T分別為有絲分裂指數(shù)、微核率、染色體畸變率的處理值，RI為化感作用效應(yīng)?；凶饔镁C合及整體效應(yīng)以各參數(shù)的化感效應(yīng)敏感指數(shù)絕對值的算術(shù)平均值表示。

1．3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對各參數(shù)在不同處理間的差異進(jìn)行單因素方差分析（One－Way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2．1 勝紅薊不同部位以及地上部分水浸提液對蠶豆根尖有絲分裂的影響

通過觀察大量蠶豆根尖分生區(qū)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)勝紅薊提取液處理后，處于M期的細(xì)胞數(shù)目減少，有絲分裂指數(shù)下降，并且隨著提取液濃度的升高抑制率上升（圖1）。說明勝紅薊水浸提液抑制了蠶豆根尖細(xì)胞的有絲分裂，引起根尖生長減緩。其中葉、莖、花以及地上部分均在0．005 0 g／mL和0．025 0 g／mL濃度與對照組差異極顯著（p＜0．01），而在0．007 5 g／mL和0．010 0 g／mL處差異顯著（p＜0．05）。有絲分裂化感作用的綜合效應(yīng)為葉＞莖＞花＞地上部分（表1）。

圖1 勝紅薊水浸提液對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂的影響

2．2 勝紅薊不同部位以及地上部分水浸提液對蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘導(dǎo)

勝紅薊葉、莖、花以及地上部分的水浸提液均能誘發(fā)較高頻率的微核，在0．005 0～0．025 0 g／mL范圍內(nèi)，根尖具微核細(xì)胞數(shù)隨著濃度的升高而增加。其中葉、莖、花、地上部分在4個濃度下與對照組相比差異顯著或極顯著（圖2）。并且在低濃度下主要誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞產(chǎn)生單微核（圖版Ⅰ，1）；隨著濃度的升高微核率上升，同時雙微核（圖版Ⅰ，2）和三微核（圖版Ⅰ，3）數(shù)量增加，并且出現(xiàn)四微核（圖版Ⅰ，4）及細(xì)胞核消失形成多微核（圖版Ⅰ，5）的現(xiàn)象。其中誘導(dǎo)微核化感作用的綜合效應(yīng)為葉＞地上部分＞莖＞花（表1）。

圖2 勝紅薊水浸提液對蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘導(dǎo)

表1 國際上已商品化的微生物除草劑種類

2．3 勝紅薊不同部位及地上部分水浸提液對蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變的誘導(dǎo)

勝紅薊水浸提液均能誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞各時期產(chǎn)生畸變?nèi)旧w（圖3），前期主要產(chǎn)生單微核或雙微核（圖版Ⅰ，6～7）；中期除了產(chǎn)生類微核（圖版Ⅰ，8～9）主要為染色體斷裂、融合、粘連等（圖版Ⅰ，10～15）；后期為后期染色體橋、染色體環(huán)等（圖版Ⅰ，16～25，圖版Ⅱ，26～28）；末期主要產(chǎn)生末期染色體單橋、雙橋或三橋以及染色體滯后、染色體環(huán)等（圖版Ⅱ，29～41）；另外還會產(chǎn)生合胞體、核突起以及前期類微核的形成（圖版Ⅱ，42～44）。且蠶豆根尖畸變率與處理液濃度呈正相關(guān)，其中0．005 0、0．007 5、0．010 0、0．025 0 g／mL處理與對照組差異顯著或極顯著（圖3），誘導(dǎo)微核的化感作用的綜合效應(yīng)為葉＞莖＞地上部分＞花（表1）。

圖3 勝紅薊水浸提液對蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變的誘導(dǎo)

圖版Ⅰ

圖版Ⅱ

3 討論

鏡檢中凡是主核大小1／20～1／3，著色與主核相當(dāng)或稍淺并與主核完全分離的小核，作為細(xì)胞中的微核。細(xì)胞中多數(shù)具有1個微核，少數(shù)具有2個微核，個別細(xì)胞有3～5個微核。研究結(jié)果表明（表1），蠶豆根尖細(xì)胞對勝紅薊水浸提液非常敏感。在所研究濃度范圍內(nèi)，經(jīng)過勝紅薊水浸提液的作用，蠶豆根尖細(xì)胞的有絲分裂率下降并出現(xiàn)了染色體斷片、染色體橋、滯后染色體、染色體粘連以及染色體多極分布等多種染色體畸變現(xiàn)象（圖版Ⅰ－Ⅱ，10～43），表明勝紅薊水溶性化感物質(zhì)抑制了蠶豆根尖細(xì)胞紡錘體的形成并破壞了紡錘體的正常結(jié)構(gòu)與功能，對植物的遺傳穩(wěn)定性及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)具有一定的影響，可以造成染色體斷裂和損傷，造成不可逆的遺傳損傷效應(yīng)，具有較強(qiáng)的遺傳毒性。從本試驗結(jié)果可以看出，勝紅薊化感物質(zhì)對蠶豆的遺傳毒物性質(zhì)具有斷裂劑和非整倍體劑兩種。斷裂劑可以誘發(fā)染色體的斷裂，當(dāng)斷裂不發(fā)生重接或重接不在原處，即可出現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常（圖版Ⅰ，10、11、19、20和圖版Ⅱ，27、34、38、39為染色體斷片；圖版Ⅰ，22～25及圖版Ⅱ，32～37為染色體橋）。非整倍體劑在細(xì)胞分裂時可以誘發(fā)不分離現(xiàn)象或形成滯后染色體（這主要是破壞蠶豆有絲分裂細(xì)胞的紡錘體），滯后染色體最終形成微核［15］（圖版Ⅰ，1～5等為微核）。勝紅薊水浸提液既能誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生微核又能使染色體產(chǎn)生多種畸變現(xiàn)象，因此其化感物質(zhì)既有斷裂劑又有非整倍體劑的作用。上述試驗結(jié)果表明，勝紅薊作為外來入侵物種之所以可以成功入侵，其中一個重要原因是其植物體具有化感物質(zhì)（當(dāng)然還有許多其他因素，如菊科植物種子超強(qiáng)繁殖能力和種子的高效傳播方式等等），并且其化感物質(zhì)對入侵生境中其他植物的化感作用是造成細(xì)胞有絲分裂過程中染色體斷裂和損傷，另一方面勝紅薊的化感物質(zhì)還具有破壞有絲分裂中紡錘體結(jié)構(gòu)及功能的作用，其最終結(jié)果是造成有絲分裂時染色體滯后或染色體不分離或染色體多極分布，從而形成非整倍體和微核現(xiàn)象。進(jìn)而周圍植物生長受到抑制甚至致死而勝紅薊則可成功入侵。

在自然界中，多數(shù)入侵植物的化感物質(zhì)主要通過根系分泌、葉片淋溶、雨水淋溶、殘株分解、種子滲出以及根系分泌等方式進(jìn)入土壤，并在土壤中進(jìn)行累積、轉(zhuǎn)化、遷移最終抑制周圍植物的生長發(fā)育達(dá)到快速擴(kuò)散、成功入侵的目的。由于植物通過不同的途徑合成、釋放化感物質(zhì)以及植物不同部位代謝的差異，致使產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)種類和數(shù)量也不相同，從而使不同部位的化感作用潛力及其強(qiáng)度表現(xiàn)出一定的差異［16－17］。葉片作為勝紅薊植株光合作用的主要場所含有較多的化感物質(zhì)，產(chǎn)生的化感效應(yīng)最強(qiáng)烈；莖干主要承擔(dān)機(jī)械支持和物質(zhì)輸導(dǎo)的功能而并非物質(zhì)合成的場所，次生代謝產(chǎn)物的含量相對較低，化感效應(yīng)偏弱［18］；而花是勝紅薊的有性繁殖器官，主要用于吸引昆蟲進(jìn)行傳粉，完成受精過程進(jìn)而產(chǎn)生種子，化感效應(yīng)亦較弱。本研究結(jié)果顯示，在4個濃度下勝紅薊的莖、葉、花的綜合化感效應(yīng)敏感指數(shù)（RI）在有絲分裂、微核率以及染色體畸變中均為葉＞花＞莖。但是在4個濃度下葉、莖、花與地上部分的綜合化感效應(yīng)在有絲分裂、微核率以及染色體畸變中各不同。誘導(dǎo)微核的化感作用綜合效應(yīng)為葉＞地上部分＞莖＞花；染色體畸變化感作用綜合效應(yīng)為葉＞莖＞地上部分＞花；有絲分裂化感作用綜合效應(yīng)為葉＞莖＞花＞地上部分。由此可見勝紅薊葉、莖、花不同部位的化感作用潛力不是簡單的加合作用，而是不同部位對蠶豆細(xì)胞有絲分裂、微核誘導(dǎo)以及染色體致畸3方面具有不同的化感作用效果，這可能是由于不同部位產(chǎn)生的化感物質(zhì)種類不同，但其具體機(jī)制和作用途徑有待于進(jìn)一步研究。在0．005 0～0．025 0 g／mL范圍內(nèi)，葉、莖、花與地上部分的整體化感效用表現(xiàn)為葉＞莖＞花＞地上部分，說明葉片是勝紅薊地上部分產(chǎn)生化感作用潛力最強(qiáng)的部位。因此在對其進(jìn)行防治時要高度重視對葉片的處理，當(dāng)農(nóng)耕地中出現(xiàn)入侵植物勝紅薊時，可在其營養(yǎng)期進(jìn)行人工拔除，并將植株尤其是葉片等深埋或放于沼氣池中，不可堆積在農(nóng)耕地中。

［1］ 林忠寧，陳敏健，韓海東．勝紅薊的生物學(xué)特性及其栽培技術(shù)［J］．福建熱作科技，2007，32（3）：19－20．

［2］ 郝建華，強(qiáng)勝．外來入侵性雜草——勝紅薊［J］．雜草科學(xué)，2005（4）：54－58．

［3］ 李紅松．興安縣旱地雜草勝紅薊發(fā)生為害特點(diǎn)及防除對策［J］．廣西植保，2006，19（4）：32－34．

［4］ 胡飛，孔垂華．勝紅薊化感作用研究I．水溶物的化感作用及其化感物質(zhì)分離與鑒定［J］．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，1997，8（3）：304－308．

［5］ Singh H P，Batish D R，Kaur S，et al．Phytotoxic interference of Ageratum conyzoides with wheat（Triticum aestivu m）［J］．J Agronomy ＆ Crop Science，2003，189：341－346．

［6］ Batish D R，Kaur S，Singh H P，et al．Role of r oot－mediated interactions in phytotoxic interference of Ager atu m conyzoides with rice（Or yza sativa）［J］．Flora，2009，204：388－395．

［7］ Grant W F．Higher plant assays for the detection of chromoso mal aberrations and gene mutations—a brief historical background on their use for screening and monitoring envir on mental chemicals［J］．Mutat Res，1999，426：107－112．

［8］ 陳瑞嬌，李均祥．蠶豆根尖微核試驗在環(huán)境致突變物檢測中的應(yīng)用［J］．韶關(guān)學(xué)院學(xué)報，2006，27（9）：87－91．

［9］ 杜鳳移，于樹華，馬丹煒．三葉鬼針草對蠶豆根尖遺傳毒性的研究［J］．生態(tài)環(huán)境，2007，16（3）：944－949．

［10］馬丹煒，范雪濤，葛方蘭．低溫脅迫對辣子草水浸提液化感作用的影響［J］．熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2008，16（6）：164－168．

［11］何楊艷，馬丹煒，李群，等．溫度脅迫對白車軸草水浸提液化感作用的影響［J］．植物研究，2010，30（2）：243－247．

［12］陳麗萍，曹慕嵐，馬丹煒．入侵植物加拿大蓬遺傳毒性的初步研究［J］．四川師范大學(xué)學(xué)報，2008，31（3）：372－375．

［13］楊昌鳳，涂傳馨．快速制備蠶豆染色體標(biāo)本的一種方法［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1985（6）：18－19．

［14］ Williamson G B，Richardson D．Bioassays for allelopathy：measuring treat ment responses with independent contr ols［J］．J Chem Ecol，1988，14（1）：181－187．

［15］王淑敏，張江麗，高永闖，等．洗發(fā)水濃度對蠶豆根尖細(xì)胞遺傳毒性的研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（24）：11595－11596．

［16］全國明，章家恩，徐華勤，等．入侵植物馬纓丹不同部位的化感作用研究［J］．中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（12）：102－106．

［17］于福科，黃新會，馬永清．不同生長時期沙打旺不同部位及其植株的化感作用研究［J］．草業(yè)學(xué)報，2008，17（5）：76－83．

［18］方芳，郭水良，黃華，等．開花期加拿大一枝黃花水浸提液對3種作物種子萌發(fā)和幼苗生長的影響［J］．植物研究，2007，27（5）：569－573．