貫葉連翹中黃酮類化合物的提取及含量測定

宋宏新, 楊 芳

(陜西科技大學 生命科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

貫葉連翹HypericumperforatumL.為藤黃科金絲桃屬植物，多年生草本，全草入藥，別名有千層樓、小葉金絲桃等，在西方國家又名“St John′s wort”.在我國主要分布在陜西、貴州、四川、甘肅、江蘇等地[1].大量臨床研究己經(jīng)證實貫葉連翹對中、輕度抑郁癥有效，且副作用較傳統(tǒng)的化學抗抑郁藥物輕微，其有效成分有抗病毒，抗癌抗腫瘤以及治療肝炎，白血病等多種藥理作用[2].傳統(tǒng)中醫(yī)認為，貫葉連翹具有清心明目、調(diào)經(jīng)活血、止血生肌的功效，現(xiàn)代藥理研究表明，貫葉連翹具有抗抑郁、抗病毒、抗菌、鎮(zhèn)痛等作用[3]，近來的研究表明黃酮類成分是貫葉連翹中具有抗抑郁作用的成分之一[4].貫葉連翹已列入美國、前蘇聯(lián)、波蘭、羅馬尼亞、瑞士等國藥典[5].本實驗以黃酮類化合物的得率為指標，分別考察了提取溶劑的濃度、提取時間、提取次數(shù)、料液比對提取率的影響，以蘆丁為對照品通過比色法測定貫葉連翹提取液中總黃酮含量對該方法進行了考察.

1 材料與儀器

752型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

貫葉連翹藥材(購自西安市藥材市場，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學陳彥生研究員鑒定)；蘆丁標準品(購自中國藥品生物制品藥檢所，批號為0080-9705)；甲醇、乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH均為分析純，水為蒸餾水.

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量的測定

貫葉連翹提取液中總黃酮的含量采用分光光度法在硼酸-NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色系統(tǒng)作用下于510 nm下測定[6].標準品溶液以精密稱取干燥恒重的蘆丁標準品1.50 mg，用80%的乙醇配制100 mL，即得15μg/mL的標準貯備液.

精密吸取蘆丁標準液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于25 mL容量瓶中，加顯色劑后于可見分光光度計510 nm下測吸光度.以吸光度(A)為縱坐標，標準液的濃度(μg/mL)為橫坐標繪制標準曲線.用最小二乘法進行回歸，得蘆丁的回歸方程為A=0.011C+0.0031，R2=0.9992，蘆丁在0.015-0.075 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

稱取一定量的貫葉連翹干燥藥材粉末，加入溶劑，超聲提取，所得提取液吸取一定量于容量瓶中，分別加1%的硼酸、5%的NaNO2、10%的Al(NO3)3、1mol/L的NaOH等顯色劑后，于510 nm下測定各提取液的吸光度值，帶入回歸方程，計算得黃酮類化合物的含量，即每克貫葉連翹干燥藥材中提取出的黃酮類化合物的質(zhì)量，計算公式為：

每克干藥材中黃酮類化合物的含量=(C×V×f)/w，其中，C是被測溶液的濃度，V是定容后的體積，f是稀釋倍數(shù)，w為貫葉連翹干燥藥材的質(zhì)量.

2.2 貫葉連翹中黃酮類化合物的提取

取貫葉連翹藥材粉碎過80目篩，加入溶劑，超聲提取.

2.2.1單因素實驗

(1)超聲時間對得率的影響

稱取2.5g藥材粉末4份，以料液比1∶10，加入80%的乙醇，在45℃下超聲提取3次，每次的超聲時間分別是30 min、45 min、60 min、75 min，抽濾后收集濾液并用乙醇定容至100 mL容量瓶中，吸取0.5mL提取液于25 mL容量瓶中，按照2.1的方法測吸光度，得黃酮類化合物得率與提取時間的關(guān)系(見圖1).

圖1 得率與提取時間的關(guān)系

從圖中數(shù)據(jù)分析可知，在提取試劑、超聲溫度、試劑濃度、提取次數(shù)以及料液比等條件相同的前提下，進行不同時間的超聲輔助提取，所測定的提取液的吸光度有顯著差異，而且當超聲處理時間為60 min時，提取液中黃酮類化合物的含量最大.

(2)溶劑濃度對得率的影響

稱取2.5g藥材粉末5份，以料液比1∶10，分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在45 ℃下超聲提取3次，每次45 min，抽濾后收集濾液，同上測定吸光度，得黃酮類化合物得率與溶劑濃度的關(guān)系(如圖2所示).

從圖中數(shù)據(jù)分析可知，在提取試劑、超聲溫度、提取次數(shù)、時間以及料液比等條件相同的前提下，以不同濃度的乙醇為溶劑進行超聲輔助提取，所測定的提取液的吸光度有顯著差異，而且當乙醇的體積分數(shù)為60%時，提取液中黃酮類化合物的含量最大.

圖2 得率與溶劑濃度的關(guān)系

(3)提取次數(shù)對得率的影響

稱取2.5g藥材粉末5份，以料液比1∶10，加入60%的乙醇，在45℃下超聲提取，分別提取1次、2次、3次、4次、5次，每次45 min，抽濾后收集濾液，同上測定吸光度，得黃酮類化合物得率與提取次數(shù)的關(guān)系(如圖3所示).

圖3 得率與提取次數(shù)的關(guān)系

從圖中數(shù)據(jù)分析可知，在提取試劑、超聲溫度、試劑濃度、提取時間以及料液比等條件相同的前提下，超聲輔助處理不同的次數(shù)，所測定的提取液的吸光度值隨著次數(shù)的增加而變大，但是當提取次數(shù)達2次以上時，隨提取次數(shù)的增加，吸光度值變化不大，考慮到實驗成本及便捷性，選擇超聲輔助提取2次為最佳.

(4)料液比對得率的影響

稱取2.5g藥材粉末5份，加入60%的乙醇，在45℃下分別以料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30進行超聲提取2次，抽濾后收集濾液，得黃酮類化合物得率與料液比的關(guān)系(見圖4).

圖4 得率與料液比的關(guān)系

從圖4中數(shù)據(jù)分析可知，在提取試劑、超聲溫度、試劑濃度、提取次數(shù)、時間等條件相同的前提下，以不同的料液比進行超聲輔助提取，所測定的提取液的吸光度有顯著差異，而且當料液比為1∶20時，提取液中黃酮類化合物的含量最大.

2.2.2正交試驗與結(jié)果

考慮溶劑濃度，提取時間，料液比，提取次數(shù)4個因素對提取貫葉連翹中黃酮類化合物的得率影響，設(shè)計四因素三水平L9(34)的正交試驗，因素水平的設(shè)計見表1.

表1 因素水平表

稱取質(zhì)量為1.0 g的貫葉連翹干燥藥材粉末，分別按照表2中試驗號對應的提取條件進行超聲輔助提取，所得提取液于可見分光光度計510 nm下測定吸光值，并帶入回歸方程中計算黃酮類化合物的含量，結(jié)果見表2.

表2 正交試驗表

從表2的實驗結(jié)果中可以看出，以貫葉連翹中總黃酮的含量為指標，影響得率的因素順序為A>C>D>B ,最佳的提取工藝是A2B2C2D3，即貫葉連翹干燥藥材粉末按照料液比1∶30，以體積分數(shù)為60%的乙醇超聲輔助提取兩次，每次45min，得到的黃酮類化合物含量最大，為70.028mg/g.

3 討論

超聲波輔助提取是利用超聲波具有空化效應、機械效應以及熱效應，這些作用增大了介質(zhì)分子的運動速度，提高了介質(zhì)的穿透能力，促進藥物有效成分溶解及擴散，縮短提取時間，提高藥物有效成分的提取率，鑒于超聲波提取的特殊優(yōu)點，若將其廣泛引入到貫葉連翹的黃酮類化合物提取工藝中來，必將極大地促進其藥效成分提取的工業(yè)進程.

黃酮苷元易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，黃酮苷易溶于水，難溶于有機溶劑，因此可用水或者不同濃度的有機溶劑來提取.用不同濃度的甲醇、乙醇提取時，甲醇提取效果略高于乙醇，考慮到實驗的安全性，本研究選用乙醇的水溶液為提取溶劑.

本研究建立的比色法測定貫葉連翹中黃酮類化合物的含量，方法簡便，快捷，可操作性強.超聲提取省時實用，提取率較高.

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華草本》編委會.中華草本精選本，上冊[M] .上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1998：681-682.

[2] 李建梅，孔令東. 中醫(yī)藥治療抑郁、焦慮癥的研究進展[J] .中國中藥雜志，2001，26(12)：805-807．

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[6] 丁明玉，趙紀萍，李擎陽.貫葉金絲桃提取物中總黃酮的測定方法[J].分析實驗室,2001，20(6):45-47.