新生隱球菌性腦膜炎的腦脊液標(biāo)本檢驗(yàn)方法分析

班立芳 孔慶飛 王勇鳴 于永敏 馮 煦

河南省傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科， 河南鄭州 450015

檢驗(yàn)科常用的新生隱球菌的檢測(cè)方法有墨汁染色、革蘭染色、隱球菌抗原乳膠凝集實(shí)驗(yàn)和真菌培養(yǎng)。通過這4種方法的應(yīng)用，對(duì)其陽性率進(jìn)行比較，以提高檢驗(yàn)水平?，F(xiàn)將筆者所在醫(yī)院2011年2～11月確診新生隱球菌（CM）的55例腦脊液（CSF）標(biāo)本用以上4種方法進(jìn)行檢驗(yàn)的情況作以比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

55例患者均為AIDS合并CM，其中男36例，女19例，年齡29～62歲。以上患者病史、癥狀、體征、輔助檢查結(jié)果均符合CM表現(xiàn)；體溫37.5～39.0℃39例，＞39℃2例；進(jìn)行性頭痛47例，伴嗜睡、昏迷等意識(shí)障礙者21例。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢查

55例患者入院后分別抽取CSF 3管，第1管做真菌培養(yǎng)和生化檢驗(yàn)，第2管作做細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)和墨汁染色，第3管做隱球菌抗原乳膠凝集實(shí)驗(yàn)。CSF標(biāo)本中無色清晰46例，微混9例。墨汁染色選用印度墨汁或國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)墨汁，將CSF標(biāo)本離心后取沉淀物直接染色鏡檢，在黑色背景下可見到透亮的菌體和寬厚莢膜；真菌培養(yǎng)用沙保弱培養(yǎng)基，將標(biāo)本接種后放置于37℃孵育箱中，2～5 d后觀察菌落并做酚氧化酶試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)等鑒定試驗(yàn)；革蘭染液由貝索公司提供，涂片染色后菌體呈孢子樣；乳膠凝集實(shí)驗(yàn)采用美國IMMY公司生產(chǎn)的新生隱球菌乳膠凝集抗原檢測(cè)試劑盒，利用快速乳膠凝集反應(yīng)對(duì)標(biāo)本中隱球菌的莢膜多糖抗原進(jìn)行定性檢測(cè)，試驗(yàn)室溫下即可觀察結(jié)果，反應(yīng)環(huán)中凝集顆粒的多少和大小與反應(yīng)的陽性程度成正比，結(jié)果讀數(shù)劃分等級(jí)從陰性到4級(jí)，陽性對(duì)照應(yīng)在2級(jí)（輕微小團(tuán)塊或塊狀）以上，而陰性對(duì)照應(yīng)小于1級(jí)（乳狀背景下細(xì)小顆粒）。

2 結(jié)果

55例患者CSF檢查結(jié)果：墨汁染色陽性42例，革蘭染色陽性38例，真菌培養(yǎng)陽性49例，乳膠凝集試驗(yàn)陽性52例。4種檢驗(yàn)方法結(jié)果見表1。

表1 55例患者4種檢驗(yàn)結(jié)果 [n（%）]

3 討論

新生隱球菌是有莢膜的、類似酵母的霉菌，又稱溶組織酵母菌。廣泛存在于被鳥類糞便污染的土壤中，尤以鴿糞中檢出最多[1]。目前由于臨床上抗生素、免疫抑制劑、腫瘤放、化療的廣泛應(yīng)用和HIV的流行特別是AIDS患者的不斷增多，使CM患者明顯增多。CM是由新生隱球菌所導(dǎo)致的臨床最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染（CNS）[2]。在AIDS患者中隱球菌也是最常見的CNS感染的原因。趙建華等[3]報(bào)道12例AIDS機(jī)會(huì)性感染的患者中隱球菌腦膜炎有6例。在HIV感染人群中CM的發(fā)病率是每年0.04%～12.00%；西歐、中歐、大洋洲的中位發(fā)病率最低；每年全球大約957 900人患CM，約624 700人死亡[4]。CM的臨床癥狀一般是非特異性的，患者可以表現(xiàn)為腦膜炎的癥狀，也可以表現(xiàn)為腦膜腦炎的癥狀。大量資料說明，CM的早期明確診斷是降低患者死亡率和判斷預(yù)后的關(guān)鍵。

目前醫(yī)學(xué)上缺乏快速、敏感而又特異的檢驗(yàn)方法是CM誤診的重要原因。墨汁染色方便快捷，取CSF離心后的沉淀物用負(fù)染法找到有寬闊透明莢膜的隱球菌就能確診，是診斷CM最直接的方法。文獻(xiàn)報(bào)道墨汁染色首次檢出陽性率僅54%～74%[5]。在發(fā)病初期，墨汁染色鏡檢需多次反復(fù)檢查才能找到隱球菌。隱球菌在革蘭氏染色后呈現(xiàn)孢子樣，大小不等，透明或半透明，胞核染紫色或淡紫色，莢膜因富含多糖而不著色，這一特點(diǎn)也將細(xì)胞與隱球菌區(qū)別開來。隱球菌抗原乳膠凝集實(shí)驗(yàn)在隱球菌感染早期的診斷具有重要意義。一定程度上，抗原滴度與感染程度成正比，增高的滴度反映感染程度和簡(jiǎn)單預(yù)后，減低的滴度說明患者治療有效[6]。但在患者抗原滴度低、早期感染、高滴度的前帶影響等情況時(shí)，結(jié)果會(huì)呈現(xiàn)假陰性；而在風(fēng)濕因子存在下或試驗(yàn)操作不當(dāng)時(shí)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽性。隱球菌培養(yǎng)是確診CM的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在玉米-吐溫80培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d后涂片鏡檢，可見圓形、厚壁孢子[7]。

本研究數(shù)據(jù)顯示真菌培養(yǎng)和乳膠凝集實(shí)驗(yàn)陽性率較高，墨汁染色和革蘭染色陽性率相對(duì)較低，但每種方法又有自己的特點(diǎn)和不足之處。實(shí)際工作中，為提高早期診斷陽性率，對(duì)同一份標(biāo)本應(yīng)聯(lián)合使用3種以上方法檢測(cè)，使結(jié)果互相印證，從而為臨床提供有力證據(jù)。

[1] 劉運(yùn)德.微生物學(xué)檢驗(yàn)[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：371-373.

[2] Collazos J.Opportunistic infections of the CNS in patients with AIDS：diagnosis and management[J].CNS Drugs，2003，17（12）：869-887.

[3] 趙建華，韓雄.艾滋病中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)會(huì)性感染的特征[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2003，20（4）：373.

[4] Park BJ，Wannemuehler KA，Marston BJ，et al.Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS[J].AIDS，2009，23（4）：525-530.

[5] 趙明倫.顱內(nèi)感染性疾病[M].青島：青島出版社，1990：300-302.

[6] Lu HZ，Bloch KC，Tang YW.Molecular techniques in the diagnosis of central nervous system infections[J].Curr Infect Dis Rep，2002，4：339-350.

[7] 周庭銀.臨床微生物學(xué)診斷與圖解[M].第2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2007：126-127.