張金山 張 巖 趙 潔 李 臻 李 偉
1.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室,陜西西安 710032;2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,陜西西安 710038
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種累及關(guān)節(jié)的慢性炎癥性疾病,以炎癥、關(guān)節(jié)滑膜增生和免疫功能異常為主要病理生理特征。RA病變呈持續(xù)性、反復(fù)發(fā)作性,造成關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞,出現(xiàn)不同程度的功能障礙。RA的病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚不明了,亦無針對性治療措施。近來的研究表明,自身免疫和非特異性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞的重要因素。Ghrelin是內(nèi)源性增食欲肽,可調(diào)節(jié)攝食行為和能量代謝;Ghrelin具有抗炎作用,可下調(diào)促炎癥性細(xì)胞因子,在多種炎癥性疾病包括RA中其水平可發(fā)生變化[1-3]。TNF-α是炎癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵性細(xì)胞因子,近10多年來TNF-α拮抗劑作為抗炎癥性藥物已用于RA患者的治療[4]。Gonzalez-Gay的研究發(fā)現(xiàn),給重度RA患者靜脈灌注抗TNF-α單抗(infliximab)后血清Ghrelin水平顯著升高,說明阻斷TNF-α可促進(jìn)機(jī)體內(nèi)Ghrelin的分泌,TNF-α和Ghrelin在炎癥反應(yīng)中具有相互調(diào)節(jié)作用[5]。本研究擬檢測RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中TNF-α和Ghrelin水平的變化,并分析兩者之間的相關(guān)性,為進(jìn)一步探討RA的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供理論依據(jù)。
選擇第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院風(fēng)濕免疫科收治的36例活動(dòng)期RA患者,臨床診斷均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1987修訂的RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn),其中男11例,女25例,平均年齡(48±12)歲,這些患者均無其他慢性病史,未接受過激素或免疫抑制劑治療。健康對照組36例為本院健康體檢者,男12例,女24例,平均年齡(42±11)歲。
1.2.1 標(biāo)本采集 RA組與正常組均于清晨8:00~9:00,空腹采取肘靜脈血5 mL,注入試管待凝固后,4℃ 3 000 r/min離心10 min,分離血清,置于-70℃冰箱保存待測。另對RA患者均接受膝關(guān)節(jié)外上方為穿刺點(diǎn),用無菌注射器收集關(guān)節(jié)滑液4 mL。于2 000 r/min離心10 min,收集上清液,保存于-70℃冰箱保存待測。上述所有操作均在征得患者同意后實(shí)施。
1.2.2 血清和關(guān)節(jié)滑液Ghrelin水平測定 Ghrelin檢測EIA試劑盒購自ADL(Adlitteram Diagnostic Laboratories)公司,EIA法檢測的具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行,主要程序如下:(1)空白孔內(nèi)依次滴加標(biāo)準(zhǔn)品、血清或滑液樣品100 μL;(2)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品孔中加入酶標(biāo)記液50 μL,37℃孵育反應(yīng)60 min;(3)洗板機(jī)清洗5次;(4)在標(biāo)準(zhǔn)品或樣品孔中加入底物A、B液各50 μL,37℃避光孵育反應(yīng)15 min;(5)每孔加入終止液50 μL,終止反應(yīng);(6)混勻,用酶標(biāo)儀檢測各孔的A值(450 nm濾色片)。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用(x ± s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn);相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson分析法。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,Ρ<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
Ghrelin與TNF-α水平檢測結(jié)果如表1所示,活動(dòng)期RA患者血清Ghrelin水平顯著低于正常對照組(P<0.05),而TNF-α水平明顯高于正常對照組(P<0.01);活動(dòng)期RA患者關(guān)節(jié)滑液Ghrelin和TNF-α水平均顯著高于血清 (P<0.05)。
RA患者關(guān)節(jié)滑液中Ghrelin與TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)(r=0.819,P<0.05);而RA患者血清中Ghrelin與TNF-α水平相關(guān)性不顯著(r=0.364,P>0.05)。
慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥是RA的重要病理學(xué)特征,這種免疫性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞,多種細(xì)胞因子參與了關(guān)節(jié)滑膜的炎癥反應(yīng),這些因子相互干擾、相互作用。Ghrelin是日本學(xué)者Kojima等[6]首先從胃黏膜分離純化的第一個(gè)生長激素促分泌劑受體的內(nèi)源性配體,是一種含28個(gè)氨基酸的肽類激素。其主要功能是通過垂體生長激素促分泌劑受體刺激生長激素分泌,調(diào)節(jié)攝食行為和維持機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)。近來的研究表明,Ghrelin可調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng),在炎癥反應(yīng)中Ghrelin可下調(diào)促炎癥性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α),包括RA在內(nèi)的多種炎癥性疾病中其水平可發(fā)生變化[1-5]。TNF-α是炎癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵性促炎性細(xì)胞因子,TNF-α拮抗劑作為抗炎癥性藥物已用于RA患者的治療[4-5,7-8]。在免疫系統(tǒng)和代謝調(diào)節(jié)中TNF-α和Ghrelin的相互作用,外源性Ghrelin抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α生成;TNF注射后小鼠血漿Ghrelin水平下降、并引起食欲降低,而同時(shí)注射Ghrelin可逆轉(zhuǎn)TNF-α的效應(yīng),這提示抑制TNF-α可增加體內(nèi)Ghrelin分泌,促進(jìn)攝食和改善營養(yǎng)狀況。先天性心臟病患兒血漿Ghrelin升高、并且與TNF-α水平呈正相關(guān)[9-11]。
本研究結(jié)果顯示,活動(dòng)期RA患者血清中Ghrelin水平降低、TNF-α水平升高;首次觀察了RA患者關(guān)節(jié)滑液中Ghrelin水平,發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)滑液中Ghrelin和TNF-α水平高于血清,且滑液中Ghrelin與TNF-α呈顯著負(fù)相關(guān),這提示Ghrelin可能與TNF-α相互作用、共同參與RA的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。由于本研究未能獲取正常對照組的關(guān)節(jié)滑液,因而無法比較RA患者和正常人群關(guān)節(jié)滑液中Ghrelin的差異。進(jìn)一步的研究應(yīng)在RA動(dòng)物模型上探討關(guān)節(jié)滑液中Ghrelin與炎癥性細(xì)胞因子的關(guān)系,以闡明Ghrelin在RA發(fā)生、發(fā)展中的作用及其病理生理學(xué)機(jī)制。
關(guān)于RA患者血循環(huán)中Ghrelin水平變化的研究結(jié)果尚存在一定爭議。Otero等[1]首先報(bào)道,RA患者血漿Ghrelin水平較正常對照明顯降低;而在福氏完全佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(AA)模型大鼠,7d時(shí)AA組大鼠血漿Ghrelin水平顯著低于對照組、15 d時(shí)恢復(fù)至對照組水平。Granado等[12]觀察了GHRP-2(一種Ghrelin激動(dòng)劑)對大鼠AA的抗炎效應(yīng),發(fā)現(xiàn)AA大鼠血清Ghrelin水平升高,給予GHRP-2(100μg/kg)腹腔注射8 d后AA大鼠癥狀和患肢腫脹程度改善、降低關(guān)節(jié)炎評分和血清IL-6水平。而Koca等[13]的研究表明,RA患者血清總Ghrelin水平低于Behcet’s病患者和正常對照組,各組間酰基化Ghrelin水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;血清Ghrelin水平與RA患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)無顯著相關(guān)性。在ANCA-相關(guān)性脈管炎患者治療前血清Ghrelin水平是治療后的2倍,并且Ghrelin水平與疾病活動(dòng)指標(biāo)(包括C-反應(yīng)蛋白)有關(guān)[14]。這些研究結(jié)果的不一致可能與所選病例、實(shí)驗(yàn)條件和營養(yǎng)狀況等因素有關(guān)??筎NF-α單抗(infflixmab)靜脈灌注120min后重度RA患者血清中Ghrelin水平顯著升高,并且伴有P-選擇素水平降低,說明阻斷TNF-α可促進(jìn)機(jī)體內(nèi)Ghrelin的分泌,從另一個(gè)層面證明Ghrelin可抑制促炎因子的合成與分泌[5]。青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患者血漿Ghrelin水平較對照組顯著降低,給予抗TNF-α治療后Ghrelin恢復(fù)至對照水平,并且患者Ghrelin水平變化與機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)、能量平衡和食欲等因素?zé)o明顯相關(guān)性,提示Ghrelin可能獨(dú)立于其他指標(biāo)參與RA的發(fā)病,并與TNF-α共同調(diào)節(jié)RA的發(fā)生與發(fā)展。深入研究Ghrelin在RA發(fā)生中的作用及其與TNF-α的相互作用機(jī)制,有助于闡明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的病理機(jī)制,為開發(fā)以Ghrelin為靶點(diǎn)的藥物治療骨關(guān)節(jié)炎癥性疾病提供理論基礎(chǔ)。
表1 兩組血清和關(guān)節(jié)滑液中Ghrelin和TNF-α水平比(x ± s,pg/m L)
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