淺談分子標記技術鑒定玉米種子純度

杜 爽，張 巖，王 軒

（天津市種子管理站，天津 300061）

玉米種子純度（是指品種在特征特性方面典型一致的程度）是檢查玉米種子質量的重要指標之一，鑒別種子的純度對玉米生產具有決定性作用。目前，檢驗方法主要包括田間檢驗、室內檢驗和田間種植檢驗。

隨著我國玉米種子市場的快速發(fā)展，傳統(tǒng)檢驗手段已存在很大局限性，所以，急需我們建立一套簡便、快速、經濟和準確的種子純度檢測技術體系。

DNA分子標記技術是以DNA堿基序列的差異進行分析對比，從而鑒別不同品種。其檢測對象是種子DNA的片段（基因），并沒有器官的特異性，且不受外部環(huán)境的影響，所以，有較高的準確性、穩(wěn)定性和重復性。目前，在玉米品種鑒定中應用的有RFLP技術、RAPD技術、AFLP技術和SSR技術等。

1 RFLP技術

限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，簡稱 RFLP）指一個品種的DNA片段長度多態(tài)性。它是在1974年由Grodzicker等創(chuàng)立一種以DNA-DNA雜交為基礎最早發(fā)展起來的第一代遺傳標記。其原理是用限制性內切酶酶切不同品種的DNA，由于DNA經限制性內切酶消化產生了長度不等、分子質量大小不同的片段，通過瓊脂凝膠電泳分離大小不同的DNA片段，轉移凝膠中的DNA到尼龍膜或硝酸纖維素膜上，用放射性同位素或生物素標記的探針進行Southern雜交，經放射顯影后，可觀察待鑒定品種的RFLP指紋，經與標準品種RFLP指紋圖譜比較后，即可對此品種進行純度分析。它反映了DNA序列中核苷酸排列順序的差異，RFLP標記的多態(tài)性來源于基因組限制性酶切位點的突變及相鄰位點間DNA結構重排 （包括缺失、重復、異位和插入）。

玉米種子中存在豐富的限制性片段長度的多態(tài)性，可作玉米品種的DNA指紋鑒定。RFLP多態(tài)性穩(wěn)定，容易重復，結果準確。但該技術多態(tài)有限、成本昂貴且耗時較長，同時放射性同位素的使用會影響人體安全，限制了在實踐中的應用。

2 RAPD技術

隨機擴增多態(tài)性 DNA（Random Amplified Polymorphism DNA，簡稱 RAPD）是 1990年由美國杜邦公司的Williams和加利福尼亞生物研究所的Welsh等人一起發(fā)明的分子標記技術。以DNA為模板，以一個隨機的寡核苷酸序列為引物，通過PCR擴增反應，產生不連續(xù)的DNA產物，擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用EB或銀染色，以檢測DNA序列的多態(tài)性。膠上呈現出的每條譜帶對應品種基因組中的一個遺傳位點，不同位點擴增產物的有無構成了品種的多態(tài)性。RAPD多態(tài)性主要與隨機引物結合的靶位點的突變、引物結合位點間DNA堿基序列的缺失和插入有關。RAPD技術與多種指紋圖譜分析軟件相結合，廣泛應用于玉米種質研究及品種純度鑒定和真實性檢測中，在生產上主要應用于新品種（系）、優(yōu)良單株及有重要應用價值的玉米遠緣種鑒定等。

RAPD技術反應靈敏、多態(tài)性強、操作簡便、速度快且費用低，既有大量的隨機引物可供篩選之用，又不受種屬的限制。盡管RAPD具有穩(wěn)定性和重演性差的缺點，但是，有研究指出具有高質量的DNA、穩(wěn)定的PCR反應條件、穩(wěn)定的程序、適宜的引物以及在整個過程中設置重復，就能獲得理想的純度鑒定結果。

3 AFLP技術

擴增片段長度多態(tài)性（Amplification Fragment Length Polymorphism，簡稱AFLP）是 1992年由荷蘭科學家Zabean等人于1993年發(fā)明的一項專利技術，它結合了RFLP與PCR的優(yōu)點，具RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術的高效。 指植物基因組DNA經限制性內切酶的酶切后，形成分子量大小不等的隨機限制性片段，然后將特定的接頭連接在這些DNA片段的兩端，形成一個帶接頭的特定片段.再通過接頭序列和PCR引物末端的識別進行PCR擴增，最終通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將這些特異的限制性片段分離開來，從而顯示出擴增片段長度的多態(tài)性。得到的DNA圖譜可用于品種純度鑒定。

該技術避免了分子雜交的復雜程序，靈敏度高、快速、多態(tài)性強、DNA的用量少且具較好的重復性，在玉米種質資源鑒定和類群劃分上得到廣泛研究。但是，操作技術較為繁瑣、時間長且步驟多，并對操作者實驗技能及儀器設備的精密度要求很高，且成本較高（專利技術受專利法保護），當前使其在種子純度的快速檢測普及應用仍存在一段距離，所以該法不適合大面積普及推廣。但是，如果該方法能簡化并降低成本，將成為極有推廣前途的一項種子純度檢測的實用技術。

4 SSR技術

在高等生物基因組合普遍分布著由1～6個堿基組成的簡單重復序列 （Simple Sequence Repeat，SSR)， 又稱為微衛(wèi)星 DNA（Microsatellite DNA）。微衛(wèi)星位點兩側的序列是相當保守的單拷貝序列，可以根據兩側序列設計一對引物進行PCR擴增。然后經聚丙烯酰胺凝膠電泳或高濃度瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物，經EB或銀染色，從而精確地檢測出特定位點微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性，這種多態(tài)性遠多于RFLP的多態(tài)性，是一種較為理想的DNA標記技術，在玉米品種鑒定上進行了廣泛的研究。由于該標記技術具有共顯性、多態(tài)性豐富、重復性強、操作簡便和快速的特點，非常適于在種子公司及管理部門推廣應用，因此，當前被認為是用于玉米品種純度鑒定的最可靠且實用的分子標記技術。

與其它方法相比，應用分子標記技術鑒定玉米種子純度具有多態(tài)性豐富、準確性高、重復性好及無器官發(fā)育時期的特異性等優(yōu)點，且不受環(huán)境影響，但所需儀器精密、藥品昂貴，程序復雜。每一種技術都有其自身的優(yōu)缺點，有些技術還不能大規(guī)模應用，還需繼續(xù)深入完善和研究。因此，在進行具體的種子純度檢測時，應該根據具體情況靈活掌握，充分發(fā)揮各種技術優(yōu)勢，綜合應用，建立有效的技術體系才能達到準確、經濟和快速檢測的目的。

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