腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與氨基糖苷類抗生素耳中毒

林墾 綜述 馬靜 張鐵松 阮標(biāo) 審校

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain－derived neuotrophic factor，BDNF）是1982 年德國神經(jīng)生物學(xué)家Barde等從豬腦中分離出來的小分子蛋白質(zhì)，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的成員之一，該家族的其他成員還有NGF、NT3和NT4／5［1］。研究顯示，BDNF 對離體和在體聽神經(jīng)受損傷神經(jīng)元有存活和再生作用［2，3］，BDNF和NT3對來源于神經(jīng)嵴和基板的感覺神經(jīng)元?dú)埓婕?xì)胞有促進(jìn)保護(hù)作用［4］。氨基糖苷類抗生素在臨床上被廣泛用于控制革蘭氏陰性和陽性菌感染，但此類抗生素具有嚴(yán)重的耳毒性副作用，可使患者發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的聽力損失。已有研究證實(shí)BDNF是聽覺和前庭神經(jīng)元發(fā)育過程中生存的關(guān)鍵營養(yǎng)因子，對成年豚鼠氨基糖苷類抗生素致聾有明顯的保護(hù)作用［5］。利用基因治療的途徑是目前感音神經(jīng)性聾基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中的重點(diǎn)課題。本文就腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與氨基糖苷類抗生素耳中毒方面的研究作一簡要綜述。

1 氨基糖苷類藥物耳毒性及其機(jī)制

1.1 氨基糖苷類抗生素在內(nèi)耳的蓄積 與其他組織相比較，耳蝸中存在由微血管內(nèi)皮細(xì)胞為主構(gòu)成的血－ 迷路屏障結(jié)構(gòu)，該屏障限制了氨基糖苷類抗生素通過的速度，致使內(nèi)耳外淋巴液中藥物濃度上升及藥物消除緩慢［6］。氨基糖苷類抗生素在外淋巴液中的半衰期遠(yuǎn)長于血液中的半衰期，這就造成了藥物在內(nèi)耳淋巴液中的聚集，從而對前庭和耳蝸毛細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。不同部位的毛細(xì)胞攝取氨基糖苷類抗生素的順序不同，氨基糖苷類抗生素可長時(shí)間地停留在毛細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)成氨基糖苷類抗生素?fù)p傷耳蝸聽覺功能和慢性損害的重要基礎(chǔ)［7］。

1.2 氨基糖苷類抗生素對內(nèi)耳毛細(xì)胞的損傷 氨基糖苷類抗生素基本上被耳蝸內(nèi)所有類型的細(xì)胞攝取，包括未被藥物損傷的細(xì)胞，除毛細(xì)胞外，還有基底膜下的間質(zhì)細(xì)胞、Ⅲ型成纖維細(xì)胞都對氨基糖苷類抗生素都有高親和力，并在攝取后使藥物長時(shí)間潴留［8］。細(xì)胞的死亡可分為壞死和凋亡兩大類［9］。氨基糖苷類抗生素通過損傷毛細(xì)胞線粒體和溶酶體兩個(gè)途徑致毛細(xì)胞壞死［7］。氨基糖苷類抗生素在進(jìn)入毛細(xì)胞后觸發(fā)了活性氧及JNK 酶的活性，導(dǎo)致了毛細(xì)胞線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C 的釋放，激活了凋亡及核酸，并出現(xiàn)核固縮，最終出現(xiàn)毛細(xì)胞的壞死或凋亡［10］。陸文銓等［11］對豚鼠研究表明，耳蝸柯替器毛細(xì)胞凋亡與氨基糖苷類抗生素耳毒性的產(chǎn)生具有緊密的關(guān)系；同樣，柱細(xì)胞、Deiters以及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和血管紋細(xì)胞也有存在凋亡現(xiàn)象。

1.3 氨基糖苷類抗生素對螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損傷 組織學(xué)研究表明，氨基糖苷類抗生素可致動(dòng)物耳蝸神經(jīng)腫脹、脫髓鞘、樹突退行性變，同時(shí)觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)微絲變化，核周體退變，線粒體層狀小體形成，甚至螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性死亡［12］。王大君等［13］觀察硫酸慶大霉素對體外培養(yǎng)的小鼠的耳蝸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生存數(shù)和細(xì)胞突起長度的影響，結(jié)果顯示硫酸慶大霉素對小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的生存?zhèn)€數(shù)無明顯影響，提示氨基糖苷類抗生素對螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響可能是繼發(fā)性的。

鄧嘉虹等［14］觀察到慶大霉素對小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電生理特性的影響，結(jié)果顯示慶大霉素通過抑制螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的鉀離子通道而產(chǎn)生耳毒性。此外，許多學(xué)者根據(jù)氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)的自由基損傷學(xué)說，在應(yīng)用氨基糖苷類抗生素時(shí)，應(yīng)用抗氧化劑或自由基清除劑，甚至基因治療來預(yù)防氨基糖苷類抗生素耳毒性的報(bào)告已有不少，但很少符合實(shí)際的臨床應(yīng)用［15］。李明棟等［16］觀察到慶大霉素作用下豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bcl22 和Bax 的表達(dá)發(fā)生了顯著的變化，表明bcl22和Bax與慶大霉素誘導(dǎo)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，bcl22家族參與了慶大霉素誘導(dǎo)的耳蝸細(xì)胞凋亡。上述研究說明氨基糖苷類抗生素造成螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的作用機(jī)制還無明確一致的結(jié)果，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2 BDNF對耳蝸的保護(hù)作用

BDNF通過抑制活性氧產(chǎn)物可達(dá)到對慶大霉素?fù)p傷的毛細(xì)胞的保護(hù)作用，與D－蛋氨酸、NG－硝基－L精氨酸甲酯（NG－nitro－L－arginie methy l ester，L－NAME）聯(lián)合使用其保護(hù)作用更強(qiáng)［17］。李鵬等［18］研究表明，轉(zhuǎn)染內(nèi)耳的BDNF可保護(hù)外毛細(xì)胞，抑制順鉑對耳蝸聽功能的損害［18］。鄭國璽等［19］報(bào)道BDNF能減少毛細(xì)胞的死亡，對新生大鼠耳蝸毛細(xì)胞具有保護(hù)作用。目前就BDNF 對毛細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制報(bào)道不多，但以上實(shí)驗(yàn)表明神經(jīng)營養(yǎng)因子確實(shí)可減少氨基糖苷類抗生素對毛細(xì)胞的損害，其機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

活體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BDNF 和NT3 mRNA 在平衡聽覺的神經(jīng)移植中可以誘導(dǎo)神經(jīng)軸突的生長［4］。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，BDNF 持續(xù)灌注豚鼠耳蝸后可對氨基糖苷類耳毒性藥物致聾后的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體及樹突起保護(hù)作用，并且電聽覺反應(yīng)的敏感性隨之相應(yīng)提高［20］。Shinohara等［21］利用電極植入注有神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子）的耳聾豚鼠耳蝸，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營因子不僅提高了螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的成活率，更重要的是提高了聽覺系統(tǒng)對電刺激的反應(yīng)性。這些結(jié)果都顯示，BDNF 和NT3（不包含NT5和NGF）是耳蝸和前庭神經(jīng)元中最初營養(yǎng)保護(hù)因子。陳謙等［22］利用噪聲制備豚鼠耳聾模型，在噪聲損傷7d 后，通過圓窗膜注入以腺病毒為載體的重組Ad－BDNF，4周后，取耳蝸組織固定切片，進(jìn)行BDNF 抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色和HE 染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的BDNF 基因可長期表達(dá)于內(nèi)耳中，并且可在噪聲引起毛細(xì)胞死亡后有效地抑制聽神經(jīng)元的退行性變。張青松等［23］研究豚鼠耳蝸在順鉑干預(yù)后螺旋神經(jīng)節(jié)BDNF和NGF出現(xiàn)高表達(dá)，提示BDNF 和NGF 對順鉑誘導(dǎo)的螺旋神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。朱綱華等［24］觀察腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾骨髓基質(zhì)細(xì)胞對體外培養(yǎng)小鼠螺旋神經(jīng)元的影響，結(jié)果顯示在體外BDNF 基因工程細(xì)胞能促進(jìn)螺旋神經(jīng)元的生長，并保護(hù)螺旋神經(jīng)元免受氧化損傷。翟所強(qiáng)等［25］用腺病毒攜帶的神經(jīng)營養(yǎng)因子注入噪聲損傷的耳蝸發(fā)現(xiàn)，BDNF 可有效地阻止和延緩螺旋神經(jīng)元的退變。BDNF基因主要表達(dá)在耳蝸底回，這與它的受體表達(dá)部位是一致的，而NT3則與BDNF表達(dá)部位相反，正是這兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子的聯(lián)合作用在出生后的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中起重要作用［26］。也有學(xué)者認(rèn)為胚胎期的BD－NF主要表達(dá)在蝸尖，NT3表達(dá)在耳蝸底回，BDNF對中部和蝸尖的殘存的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有支持作用［27］。同時(shí)，研究證明在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞成活和誘導(dǎo)周圍神經(jīng)生長方面，幾種不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合作用比單獨(dú)一種因子的作用要顯著［21］。聽泡中的BDNF和NT3mRNA 在誘導(dǎo)平衡神經(jīng)節(jié)軸突向內(nèi)生長的過程中及開始前的表達(dá)，都證明了NT3或者BDNF或者是兩者同時(shí)應(yīng)用都可以用作早期神經(jīng)纖維的生長誘導(dǎo)。其他結(jié)果也同樣證明這些神經(jīng)營養(yǎng)因子在耳蝸和前庭神經(jīng)元的以后研究中占據(jù)重要地位［4］。

3 BDNF對耳蝸的保護(hù)作用的可能機(jī)制

3.1 BDNF 和酪氨酸激酶B（tryosine kinase B，TrKB）在聽神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá) 發(fā)育成熟的人的BDNF序列與豬、鼠的BDNF 完全相同，而且與發(fā)育成熟的人的NGF、NT3和NT4／5約有50%的同源性［28，29］。BDNF和NT3及其受體對外毛細(xì)胞的分布起很重要作用［30］。在感覺上皮內(nèi)，NT3和BDNFmRNA 在聽泡的特定區(qū)域有強(qiáng)表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)BDNF在聽覺神經(jīng)元中有強(qiáng)表達(dá)，NT3也有中等強(qiáng)度表達(dá)，在內(nèi)耳的表皮細(xì)胞中含有這些神經(jīng)營養(yǎng)因子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，聽覺神經(jīng)元中有高水平的TrKB，中等水平的酪氨酸激酶C（TrKC）。在內(nèi)耳的感覺上皮中缺乏明確的酪氨酸激酶S（TrKS）表達(dá)的方法，但其亞群在聽覺平衡系統(tǒng)中表達(dá)酪氨酸激酶A（TrKA）（約15%）、TrKB（約65%）和TrKC（約45%），它們協(xié)同組成部分神經(jīng)營養(yǎng)素酪氨酸激酶（TrK）系統(tǒng)，但它們的具體作用仍然有待研究［31］。TrKB是癌基因TrK 編碼的BDNF 酪氨酸蛋白激酶受體，基因敲除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BDNF 和TrKB基因敲除的小鼠約80%的耳蝸前庭神經(jīng)元和Ⅱ型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失［32］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NT3的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物出現(xiàn)在聽覺器官和前庭的不同感覺上皮細(xì)胞和支持細(xì)胞中，在這些感覺上皮細(xì)胞中，NT3的表達(dá)強(qiáng)度呈級度遞加，但是BDNF的表達(dá)限制在聽覺器官、前庭器官的感覺上皮細(xì)胞及壺蝮脊細(xì)胞中［4］。嚙齒類動(dòng)物中，TrKB 基因能產(chǎn)生若干不同的轉(zhuǎn)錄物，其中有兩種mRNA 編碼全長或催化形式的TrKB，是介導(dǎo)BDNF 主要生物學(xué)活性的受體［33］。TrKB可以被BDNF和NT3激活，TrKC 產(chǎn)物有NT3的作用受體［4］。BDNF 與TrKB 高度特異性結(jié)合后可以快速產(chǎn)生自動(dòng)磷酸化過程，而啟動(dòng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)其作用機(jī)制。

3.2 BDNF 對耳蝸的保護(hù)途徑 推測BDNF 對毛細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制是抑制由慶大霉素及順鉑耳毒性產(chǎn)生的活性氧。BDNF與鈣蛋白酶抑制劑聯(lián)合使用對慶大霉素?fù)p害毛細(xì)胞的保護(hù)無增強(qiáng)輔助效應(yīng)，因鈣蛋白酶抑制劑是抑制氨基糖苷類抗生素致毛細(xì)胞凋亡的作用，據(jù)此推測BDNF 可能不參與抑制毛細(xì)胞的凋亡［17］。

BDNF的神經(jīng)營養(yǎng)作用非常廣泛，對外周和中樞的多種神經(jīng)元具有營養(yǎng)作用，能夠維持多類神經(jīng)元包括感覺神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、γ氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元、小腦顆粒神經(jīng)元等的存活并直接促進(jìn)軸突生長。同時(shí)對維持聽神經(jīng)元的發(fā)育和正常生理功能起重要作用。BDNF 對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)途徑主要是［34］：①通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白及其mRNA 水平，與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合，促進(jìn)鈣排出，保持胞內(nèi)Ca2＋濃度的穩(wěn)定性，從而保護(hù)神經(jīng)元免受損傷；②BDNF 通過提高胞內(nèi)抗氧化酶活性，對抗自由基以促進(jìn)細(xì)胞損傷的修復(fù)。用BDNF 處理培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，可提高胞內(nèi)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的濃度，降低谷氨酸（Glu）增高所致的自由基濃度增高；BDNF可提高谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的活性，抑制由于Glu所引起的Ca2＋濃度增高；③BDNF可以抑制興奮性氨基酸的細(xì)胞毒性。細(xì)胞損傷與興奮性氨基酸－Glu的過量釋放有直接關(guān)系。BDNF對調(diào)控NMDA 受體功能具有重要的作用，BDNF 可以通過減少NMDA 受體基因的表達(dá)，下調(diào)NMDA 受體的功能，抑制Glu的毒性。BDNF 還可以抵抗一氧化氮介導(dǎo)的Glu細(xì)胞毒性，以抑制興奮性遞質(zhì)特別是Glu的釋放，減少細(xì)胞損傷；④BDNF可以抑制細(xì)胞凋亡。BDNF可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子等上游元件調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)基因的表達(dá)，如c－fos、c－jun 等而抑制細(xì)胞凋亡、壞死的發(fā)生，這種效應(yīng)可能是通過誘導(dǎo)TrKB 受體的表達(dá)增高來實(shí)現(xiàn)的。國內(nèi)外目前關(guān)于腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與耳毒性關(guān)系的研究主要體現(xiàn)在對螺旋神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制上，而對毛細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制，以及氨基糖苷類抗生素對螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用機(jī)制都有待進(jìn)一步探討。

4 研究展望

對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的保護(hù)作用、對噪聲性聾的基因治療及對順鉑誘導(dǎo)的耳毒性保護(hù)作用都證實(shí)BDNF是內(nèi)耳發(fā)生發(fā)展的重要營養(yǎng)因子。BDNF被認(rèn)為是抗凋亡劑、鈣通道阻滯劑、谷氨酸拮抗劑、抗氧化劑的這些作用在抗耳毒性作用中也必將起到重要作用。國外文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)營養(yǎng)因子對聽神經(jīng)元的保護(hù)作用僅維持在持續(xù)給藥的治療期間［35］，也有報(bào)道腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用可維持到給藥后2周［36］。由于作用時(shí)間太短，很難應(yīng)用于臨床。隨著研究的不斷深入，BDNF 在防護(hù)神經(jīng)性聾方面也將從基礎(chǔ)研究逐步過度到臨床應(yīng)用研究。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建議以細(xì)胞為基礎(chǔ)的神經(jīng)營養(yǎng)因子治療方法，在臨床轉(zhuǎn)染治療過程中選擇包封技術(shù)來實(shí)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的傳遞，以減少和阻止感音神經(jīng)性聾聽神經(jīng)元的退行性變。如果與耳蝸植入后長期電極刺激結(jié)合應(yīng)用，期望進(jìn)一步提高聽神經(jīng)元的存活率，以擴(kuò)大和提高耳蝸植入的效果［37］。說明神經(jīng)營養(yǎng)因子不僅可以作為直接的治療方式，還可以作為協(xié)同作用，進(jìn)一步擴(kuò)大了治療的適應(yīng)證范圍，提高了現(xiàn)有治療方式的治療效果，為今后研究中選擇有價(jià)值的治療基因打下基礎(chǔ)，以便針對不同類型的感音神經(jīng)性聾采取更合理的基因治療方式。

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