非綜合征型遺傳性聾研究現(xiàn)狀及思考＊

馮永 王鴻涵

研究表明，先天性聾群體中半數(shù)以上的患者是由遺傳因素導(dǎo)致的，其中非綜合征型聾約占70%，綜合征型聾約占30%［1］。遺傳性聾一般表現(xiàn)為中重度或重度感音神經(jīng)性聾，為患者帶來嚴重的交流障礙，也為家庭和國家?guī)砹耸殖林氐呢摀?，所以遺傳性聾一直是人們關(guān)注和研究的焦點。

隨著人類基因組計劃的完成，信息技術(shù)變得空前發(fā)達，生物技術(shù)也進入了一個高速發(fā)展的時代，非綜合征型遺傳性聾相關(guān)基因研究也取得了長足進展。一方面，遺傳性聾具有高度的遺傳異質(zhì)性，在過去的十余年中人們克隆了大量耳聾致病基因，并在這些基因中鑒定了1 000 多個致病位點。另一方面，分子流行病學(xué)調(diào)查顯示大多數(shù)遺傳性聾是為數(shù)不多的幾個基因的熱點突變導(dǎo)致的，這使得基因篩查的開展具有了針對性。盡管如此，遺傳性聾的治療仍是一個世界性的難題，目前對其病因仍然缺乏有效的治療手段。本文將對非綜合征型遺傳性聾的基礎(chǔ)研究及其臨床應(yīng)用引發(fā)的思考總結(jié)如下。

1 非綜合征型遺傳性聾的基礎(chǔ)研究

1.1 致病基因的定位和鑒定 自1997年報道第一個非綜合征型遺傳性聾基因以來［2］，到2011年10月為止共定位了149個非綜合征型遺傳性聾基因座位，成功鑒定出致病基因62個（http：／／hereditaryhearingloss.org）。耳聾致病基因不僅涉及到編碼細胞間連接蛋白、細胞骨架蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等的核基因，還包括線粒體基因及一些功能未知的基因。

在我國，夏家輝院士于1998年克隆了國內(nèi)第一個耳聾致病基因——GJB3［3］，填補了我國本土遺傳性疾病基因克隆工作的空白，2002年該課題組采用全基因組掃描技術(shù)對另外一個五代遺傳性聾大家系進行研究并定位了一個新的遺傳性聾基因位點DFNA42［4］。我國其它課題組科研工作者在耳聾相關(guān)致病基因的定位和鑒定方面也做出了貢獻，定位的遺傳性聾位點有 DFNA39［5］、DFNY1［6］、AUNX1［7］、DFN2［8］和DFNA64［9］，其中DFN2 和DFNA64的責(zé)任基因已分別被鑒定為PRPS1 和DIABLO。

我國人口眾多，具有大量的遺傳性聾家系和散發(fā)病例，然而在我國本土定位或鑒定的耳聾致病基因卻很少。目前，我國仍有大量耳聾家系或散發(fā)病例的致病基因沒有被找到，我們應(yīng)該充分利用我國的遺傳資源優(yōu)勢，爭取鑒定出更多的耳聾致病基因。

致病基因鑒定的常用方法主要有功能鑒定、位置鑒定、候選基因鑒定和位置候選基因鑒定等，其中位置候選基因鑒定法是基因克隆的主要手段和方法，它首先通過連鎖分析將致病基因定位在一個區(qū)間內(nèi)，再根據(jù)生物信息學(xué)及基因功能等確定候選基因并進行突變檢測來鑒定致病基因，過去十余年中這種方法在鑒定致病基因方面發(fā)揮了很大的作用。但是，該方法也有局限性，連鎖分析依賴高質(zhì)量的家系，并且要求家系的遺傳背景單純，另外，它只能把致病基因定位到某一段區(qū)間內(nèi)，定位的區(qū)間常常包含百余個基因，定位后仍然不能夠確定致病基因，導(dǎo)致了只能定位而無法鑒定的尷尬局面，這也常常會使基因的鑒定工作陷入困境。近兩年被廣泛應(yīng)用的外顯子組測序技術(shù)（exome sequencmg）顯示了較好的應(yīng)用前景［10～14］，外顯子組測序是利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA 捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法，它只對大約1%的全基因組序列測序，所以更加高效、經(jīng)濟，數(shù)據(jù)分析起來也相對容易。目前這一新技術(shù)在耳聾致病基因的研究方面也有所應(yīng)用［15］，這將會為致病基因鑒定工作提供一條新的途徑。

1.2 致病基因的功能研究 隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，被鑒定的新致病基因的功能研究顯得越來越重要，基因功能研究也是后基因組時代的主要內(nèi)容。

傳統(tǒng)意義上的基因功能研究一般要從分子、細胞、個體等層面進行研究，根據(jù)研究數(shù)據(jù)進行綜合分析，最終獲得基因功能。

從不同層面研究新發(fā)現(xiàn)的致病基因功能之前，首先可以利用生物信息學(xué)（bioinformatics）資源對其進行功能分析，為實驗設(shè)計提供參考和指導(dǎo)。生物信息學(xué)綜合了計算機科學(xué)、信息技術(shù)、統(tǒng)計學(xué)和應(yīng)用數(shù)學(xué)等內(nèi)容，對獲得的原始信息進行存儲、管理、注釋、加工，其研究重點主要體現(xiàn)在基因組學(xué)（genomics）和蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）兩方面，最基本的內(nèi)容包括核苷酸和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。目前，常用的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫是美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的Gen Bank 數(shù)據(jù)庫（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／），該數(shù)據(jù)庫中的DNA 序列總量已超過70億堿基對，并且仍然以驚人的速度增長。Gen Bank 數(shù)據(jù)庫與歐洲生物信息學(xué)研究所（The European Bioinformatics Institute，EBI）的EMBL（European Molecular Biology Laboratory）數(shù)據(jù)庫（http：／／www.ebi.ac.uk／embl／）和日本國家遺傳學(xué)研究所（National Institute of Genetics，NIG））的DDBJ（DNA Data Bank of Japan）數(shù)據(jù)庫是目前最著名的三大核苷酸序列數(shù)據(jù)庫，這三大數(shù)據(jù)庫之間每天交換數(shù)據(jù)以實現(xiàn)各自數(shù)據(jù)的實時更新與同步。國際上著名的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫有由瑞士生物信息研究所（Swiss Institute of Bioinformatics）和EBI共同維護的SWISS－PROT 數(shù)據(jù)庫（http：／／www.ebi.ac.uk／uniprot／）以及由美國生物醫(yī)學(xué)基金會（National Biomedical Research Foundation，NBRF）創(chuàng)建的PIR（Protein Information Resource）數(shù)據(jù)庫（http：／／pir.georgetown.edu／）。生物信息學(xué)的研究方向包括基因識別、比較基因組學(xué)、基因表達、基因重組、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測、蛋白質(zhì)反應(yīng)的預(yù)測以及進化模型等諸多方面的內(nèi)容，目前生物信息學(xué)已經(jīng)發(fā)展成為了自然科學(xué)的核心內(nèi)容之一，形形色色的數(shù)據(jù)庫已經(jīng)有近千種，并且大部分的數(shù)據(jù)庫都是免費的，應(yīng)當抓住時機，運用好這些資源。

在分子層面，一般需要首先從mRNA 和蛋白兩個水平對其的表達情況進行檢測，前者主要涉及到的檢測方法有半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式擴增反應(yīng)（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）、實時定量RT－PCR 和原位雜交（in situ hybridization，ISH）等技術(shù)，而后者主要使用蛋白質(zhì)印跡（western blot，WB）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫組化（immunohistochemistry，IHC）和免疫熒光（immunofluorescence）等技術(shù)。PCR 是特定的DNA 片段在特定引物和DNA 聚合酶作用下實現(xiàn)體外克隆的一種方法。RT－PCR 是將RNA 的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA 的聚合酶鏈式擴增反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)。半定量RT－PCR 具有簡單、快速、經(jīng)濟等優(yōu)點，但是其定量的精準度不高，而熒光定量RTPCR精準度高，特異性更強、可以實現(xiàn)高通量，但是相對來說成本較高。ISH 是指將特定標記的已知順序核酸作為探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定位和定量的一種方法。它具有高度的靈敏性和準確性，在基因的定位方面具有優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于基因表達圖譜的構(gòu)建等研究領(lǐng)域，目前在臨床診斷方面也有所應(yīng)用。蛋白的表達檢測多運用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過抗體的顯色來分析蛋白的表達情況。WB是研究蛋白表達的最常用手段之一，可以依據(jù)其著色強度得知蛋白量的表達，還可以根據(jù)著色位置來確定蛋白的分子量，分子量的大小也可以在一定程度上反映蛋白有無異常，如果基因出現(xiàn)截短突變其表達的蛋白的分子量就會變小。ELISA 主要用于檢測液體物質(zhì)（諸如血清）中的蛋白表達情況。IHC主要用于細胞或組織中蛋白的定位情況。免疫熒光也稱熒光抗體技術(shù)，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位，它具有高度的特異性和敏感性，但是其判斷標準缺乏客觀性，定量方面欠精準。

在細胞水平，運用各種載體將目的基因（野生型或者構(gòu)建的突變體）導(dǎo)入某一細胞系中來觀察其在細胞中的表達情況及細胞的生物學(xué)行為來了解基因功能。同樣可以用上述分子層面研究方法檢測基因或蛋白在細胞系中的表達情況。還可以在細胞模型上檢測蛋白質(zhì)相互作用，常用技術(shù)有免疫共沉淀（co－immunoprecipitation，Co－IP）、酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two－h(huán)ybrid system）及蛋白芯片（protein array）等技術(shù)。Co－IP 是利用抗體和抗原之間的特異性作用，用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法之一，它模擬體內(nèi)試驗的環(huán)境，避免人為因素干擾，以測定兩種目標蛋白質(zhì)在自然狀態(tài)下是否結(jié)合，反映出來的結(jié)果更加可靠真實。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用，該方法靈敏度高，可以檢測到極其微弱或瞬時的蛋白間的相互作用。蛋白芯片類似于基因芯片，是將蛋白質(zhì)點到芯片上，然后與要檢測的組織或細胞等進行“雜交”，再通過自動化儀器分析得出結(jié)果。它是一種高通量檢測系統(tǒng)，通過靶分子和捕捉分子相互作用來檢測蛋白分子之間的相互作用。激酶活性和泛素化活性研究等可以用來檢測基因的生物學(xué)活性改變。

體外實驗研究往往不能夠完全真實地反映基因或者蛋白質(zhì)在體內(nèi)的生物學(xué)行為，而模式生物學(xué)已經(jīng)成為在體驗證基因功能必然的選擇，其中以小鼠為模型的研究有可能幫助人們揭開人類遺傳性聾的謎底，因為小鼠和人類的內(nèi)耳在解剖、生理等方面都有許多的相似性，并且小鼠和人類的基因組具有高度的同源性，在很大程度上表現(xiàn)為相似的功能，這使得小鼠模型成為鑒定哺乳動物和人類致病基因的常用工具。

基因功能的研究也在試圖突破傳統(tǒng)的單基因研究模式，主張從整體水平認識基因功能，不但研究某一個基因，還研究基因的表達調(diào)控、修飾基因的影響作用、基因間的相互作用等，最終在一個復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)中認識基因的功能。基因功能研究是探討致病基因發(fā)病機制以及從病因上解決遺傳性聾這一難題的必經(jīng)階段，也是以后基因治療能夠應(yīng)用于臨床的理論依據(jù)。

1.3 基因治療研究及難題 基因治療是指將外源性正?；?qū)氚屑毎脕砑m正或補償缺陷或異?；騿适У墓δ?，以達到治療疾病的目的。基因治療的可行性已經(jīng)在動物模型上得到了驗證，但是其安全性方面仍存在許多嚴重的問題，目前它仍處于實驗醫(yī)學(xué)階段。

過去10余年來，基因治療在遺傳性聾方面的基礎(chǔ)研究得到了廣泛地開展，其研究內(nèi)容主要涉及到基因載體、導(dǎo)入途徑、外源性基因及其作用靶點［16］。安全有效的基因載體對基因治療至關(guān)重要，目前所用的載體分為病毒性載體和非病毒性載體，一般認為非病毒性載體較病毒性載體更為安全，因為病毒性載體具有免疫原性、致癌性等缺點，而較低的轉(zhuǎn)染效率卻限制了非病毒性載體的應(yīng)用。內(nèi)耳基因?qū)胪緩街饕▓A窗膜途徑、鼓階途徑、半規(guī)管途徑、腦脊液途徑和內(nèi)淋巴囊途徑等，這些導(dǎo)入途徑大多數(shù)有一定的創(chuàng)傷性，會損傷內(nèi)耳功能。而完整的圓窗膜途徑被認為最有發(fā)展前景，此途徑不僅對內(nèi)耳損傷較小，還可以大大提高載體的轉(zhuǎn)染效能。而外源性基因方面主要解決導(dǎo)入基因的可控性問題，使其不至于不當表達而引起機體損傷。

2 非綜合征型遺傳性聾臨床檢測及干預(yù)

2.1 致病基因的常用檢測方法 遺傳性聾基因檢測的手段主要包括直接測序、限制酶切－單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、限制性片段長度多態(tài)性分析、變性高效液相色譜分析、基因芯片等，其中傳統(tǒng)直接測序法被認為是基因突變檢測的“金標準”，但是存在儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、耗時長、花費高等缺點，最主要的一點是難以實現(xiàn)高通量，所以其應(yīng)用受到了很大的限制。而2005年454公司首推的羅氏454測序技術(shù)，克服了傳統(tǒng)測序方法的上述缺點，但是面對天文數(shù)字般的數(shù)據(jù)，分析起來難度較大，一時普及應(yīng)用還有一定困難。相比之下，基因芯片進行突變篩查具有一定優(yōu)勢，目前在臨床上已較為廣泛的應(yīng)用。耳聾致病基因的分子流行病學(xué)調(diào)查研究顯示GJB2、SLC26A4、線粒體基因是導(dǎo)致國人遺傳性聾的“明星基因”，而GJB2 235delC、SLC26A4IVS7－2A＞G、線粒體基因A1555G 是這些基因的熱點致病突變［17～20］。據(jù)此，博奧公司和解放軍總醫(yī)院聯(lián)合開發(fā)的“晶芯?遺傳性聾基因芯片試劑盒”，該芯片可檢測4 個耳聾相關(guān)基因GJB2、GJB3、SLC26A4 和12SrRNA 的9個突變熱點［21］。目前該芯片已經(jīng)應(yīng)用于臨床并取得了一定的成效［22］。但由于遺傳性聾具有很強的遺傳異質(zhì)性，涉及的耳聾基因眾多，僅檢測少數(shù)“明星基因”的策略對耳聾基因篩查來說是遠遠不夠的，隨著生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，建立覆蓋所有已知耳聾致病基因及相關(guān)疾病位點的高通量檢測技術(shù)成為可能。基于此，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉科于2010年開始著手研制我國第一套高通量遺傳性聾致病基因檢測系統(tǒng) ——Illumina Glodengate 384K 高通量基因芯片，該芯片共涵蓋了41個國際上公認的耳聾致病基因的240 個突變位點（顯性突變位點77個，隱性突變位點163個），同時還包含了144個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點用于構(gòu)建單倍體型－連鎖分析而完成對耳聾家系成員的基因定位。運用此芯片對480例遺傳性聾患者進行了突變檢測，并對部分檢測結(jié)果經(jīng)過測序驗證（此部分內(nèi)容的數(shù)據(jù)正在進一步整理中），初步結(jié)果顯示該芯片準確性高，該芯片為開放式芯片，可以根據(jù)實際需要對芯片所設(shè)計的位點進行更改，以便跟據(jù)臨床需要做出適當調(diào)整，提示該芯片是目前技術(shù)條件下具有實用價值的芯片。

同時，其他的檢測手段也時有應(yīng)用，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院針對中國人群中相對高發(fā)的耳聾突變熱點，研發(fā)了基于PCR－RFLP 技術(shù)的“耳聾基因熱點突變檢測試劑盒”。該試劑盒集成分子生物學(xué)中簡單、廉價的技術(shù)和最新的遺傳性聾研究成果，經(jīng)濟實用，適合于開展廣泛的遺傳性聾患者的基因篩查［23］。

應(yīng)當指出的是目前任何一種檢測方法尚不能對患者做出比較全面的基因診斷?；蛟\斷定義為利用現(xiàn)代生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及表達水平是否正常，從而對疾病進行診斷的方法?？梢娔壳暗臋z測方法檢出能力還很有限，存在著很多的不確定因素，目前的基因檢測上只能稱得上是基因篩查。隨著新一代測序技術(shù)和蛋白功能數(shù)據(jù)庫的發(fā)展，也許在將來可以達到基因診斷的水平，但是這還有待研究者的共同努力。

2.2 遺傳性聾的三級干預(yù)策略 根據(jù)基因篩查結(jié)果及臨床聽力學(xué)檢查對遺傳性聾發(fā)生的不同階段我們提出了三級干預(yù)策略：

一級干預(yù)：對基因篩查陽性的病例實行產(chǎn)前干預(yù)，降低先天性聾的發(fā)病率；對特殊人群（比如SLC26A4基因突變所致的大前庭水管綜合征、線粒體DNA A1555G 突變導(dǎo)致的藥物性聾患者）及時指導(dǎo)干預(yù)，可以避免或延緩耳聾的發(fā)生；對已經(jīng)明確致病基因的大家系進行產(chǎn)前干預(yù)，避免耳聾患者出生。二級干預(yù)：對出生后的新生兒進行聽力篩查和基因篩查，根據(jù)檢測結(jié)果選擇有效的干預(yù)手段（助聽器和人工耳蝸等）和言語康復(fù)，以建立有效聽力言語功能。三級干預(yù)：對語后聾的患者根據(jù)聽力學(xué)和基因篩查結(jié)果，同樣可以采用有效的干預(yù)手段（助聽器和人工耳蝸等）改善聽力，以提高生活質(zhì)量，而基因篩查結(jié)果則可以用于產(chǎn)前指導(dǎo)。目前，國內(nèi)耳聾基因篩查對已經(jīng)生育聾兒患者的家庭或有家族史的人群進行生育指導(dǎo)方面，已有一些成功的案例報道［24，25］，其它方面也在不斷探索中。

3 結(jié)語及展望

過去近20年中，遺傳性聾的研究工作取得了很大的進展，但是就目前的情況來看該領(lǐng)域還存在很大的研究空間，研究成果在臨床上的應(yīng)用仍然處于起步階段，人們對遺傳性聾的有效治療還顯得力不從心。因此，應(yīng)在以下幾個方面加強研究。

3.1 加強耳聾致病基因的基礎(chǔ)研究 由于大量的耳聾責(zé)任基因沒有被找到，這使得一部分患者面臨找不到分子病因的困境，所以不能放松對基因克隆的研究。隨著人類基因組計劃的完成，生命科學(xué)進入了后基因組時代，基因功能的研究成為了科學(xué)研究的重要內(nèi)容。弄清耳聾基因的功能有助于詮釋聽覺產(chǎn)生的機制，這樣才可能找到聽力障礙患者的問題所在，才談得上如何解決問題。動物模型研究，特別是小鼠模型［26，27］為研究基因功能提供了很大的方便，有報道基因治療已經(jīng)能夠使耳聾小鼠恢復(fù)聽力［28］，這也為未來臨床治愈耳聾帶來了新的希望。

3.2 重視和拓展基礎(chǔ)研究在臨床上的應(yīng)用 國內(nèi)基因篩查的力度和規(guī)范化程度還遠遠不夠，尚未建立起完整的體系，對高危人群缺少正確積極的遺傳咨詢引導(dǎo)。目前基因篩查工作主要針對遺傳性聾患者開展，其臨床應(yīng)用還十分局限，應(yīng)當拓展其應(yīng)用范圍，比如基因篩查的對象可以擴展到更大的目標人群，如果對有生育要求的夫婦進行婚前或者產(chǎn)前基因篩查指導(dǎo)其優(yōu)生優(yōu)育，將會避免一部分聾兒出生。

3.3 加強臨床相關(guān)學(xué)科的發(fā)展 隨著聽力學(xué)的蓬勃發(fā)展，西方國家已經(jīng)培養(yǎng)了一些經(jīng)過系統(tǒng)教育和嚴格訓(xùn)練的臨床聽力師，在英國，這部分專業(yè)人員必須經(jīng)過嚴格臨床資格認證才能獨立從業(yè)［29］。臨床聽力師的主要任務(wù)是配合耳科醫(yī)生對耳聾患者提供臨床檢測、診斷、治療、康復(fù)、教育、預(yù)防等服務(wù)［30］，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)主要研究遺傳性疾病的發(fā)病規(guī)律和機制，在臨床診斷、預(yù)防和治療中已經(jīng)可以發(fā)揮很大作用，應(yīng)當加強醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)專業(yè)隊伍的建設(shè)，大力提倡遺傳咨詢。不同地區(qū)的醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)當開放遺傳咨詢門診，建立規(guī)范化、程序化的遺傳咨詢流程。產(chǎn)科和兒科等相關(guān)醫(yī)務(wù)人員應(yīng)普及并認識遺傳咨詢的重要性，加強對患者家屬正確的就醫(yī)指導(dǎo)。

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