高效毛細(xì)管電泳技術(shù)在現(xiàn)代中藥中的應(yīng)用*

蘇志剛，劉廣川

(天津市寶坻區(qū)藥品檢驗(yàn)所，天津 301800)

毛細(xì)管電泳又稱高效毛細(xì)管電泳(HPCE)，是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)新型分析技術(shù)，兼有電泳和色譜技術(shù)的雙重優(yōu)點(diǎn)，以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力，以樣品的多種特性(電荷大小、等電點(diǎn)、極性、親和行為、各組分之間淌度、相分配特性等)為依據(jù)的液相分離分析技術(shù)［1］。因而以高效、高速、高靈敏度、高自動(dòng)化以及樣品和試劑耗用量少、成體低、前處理簡單、抗污染能力強(qiáng)等一系列優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代中藥的研究和分析之中。HPCE按毛細(xì)管內(nèi)分離介質(zhì)和分離原理的不同主要分為:毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細(xì)管等速電泳(CITP)、毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)和毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)。中藥品種繁多，藥材產(chǎn)地廣泛，成分復(fù)雜。無論是藥材還是中成藥的分析，目前多采用薄層色譜法和HPLC法對(duì)其進(jìn)行定性或定量分析［2］，不足的是只能分析其中一個(gè)或幾個(gè)成分。自20世紀(jì)90年代初，Kenndler等［3］將HPCE首次用于熊果苷等化學(xué)成分的分離與測定以來，HPCE在現(xiàn)代中藥成分分析中的應(yīng)用得到了迅速開展，現(xiàn)將HPCE在中藥中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 中藥鑒別中的應(yīng)用

1.1 種子類藥材鑒定 胡平等［4］提取菟絲子種子植物蛋白對(duì)常用中藥菟絲子(旋花科植物菟絲子，Scuta Chinensis Lam)及其混淆品金燈藤、南方菟絲子應(yīng)用HPCE法進(jìn)行了生藥鑒定。實(shí)驗(yàn)表明，同屬不同種菟絲子的堿溶性和酸溶性蛋白在成分和含量上均有顯著差異，其結(jié)果與運(yùn)用掃描電鏡和顯微鏡鑒別的結(jié)果一致，可有效鑒別菟絲子來源。

1.2 根莖類藥材鑒定 侯連兵等［5］對(duì)三七及其混淆品菊葉三七的蛋白多肽進(jìn)行HPCE法鑒別，在酸性、堿性和中性提取液中，三七及其混淆品都存在明顯差異。王德先［6］等以天麻素的含量為主要鑒別真?zhèn)蔚闹笜?biāo)，對(duì)天麻及其偽品商陸、黃精、天花粉、大九股進(jìn)行了鑒別，結(jié)果顯示偽品均不含天麻素，同時(shí)也可以天麻素作為中藥天麻的質(zhì)量控制方法。

1.3 花、葉及果實(shí)類藥材鑒定 中藥紅花包括兩種植物。鳶尾科植物番紅花，其柱頭入藥稱作西紅花，是名貴中藥。紅花是菊科植物，花入藥。馬曉強(qiáng)等［7］對(duì)西紅花和紅花及偽品萱草和黃花菜應(yīng)用HPCE法對(duì)這些材料的水溶性成分進(jìn)行了定性分析，結(jié)果表明種間有明顯差異。王寅等［8］采用HPCE法對(duì)不同屬群的大青葉藥材進(jìn)行研究，結(jié)果表明異地栽培的不同居群大青葉藥材酸性提取液的化學(xué)成分及含量有顯著差別，依據(jù)電泳圖譜中特征峰的遷移時(shí)間和峰面積，能有效地鑒別大青葉藥材。賈江濱等［9］對(duì)烏梅及其混淆品李子的蛋白多肽進(jìn)行了HPCE法鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在酸性、堿性和中性提取液中，烏梅和李子的HPCE圖譜存在明顯差異，能有效區(qū)分烏梅及其混淆品。

1.4 動(dòng)物藥材鑒別方面 采用傳統(tǒng)方法鑒定以完整動(dòng)物體入藥的藥材，可以根據(jù)其形態(tài)特征進(jìn)行分類學(xué)鑒定。但對(duì)以動(dòng)物體某一部分入藥的藥材熊膽、穿山甲、去皮的蛇類藥材等，有時(shí)則需要組織切片，還可以采用X光拍片等技術(shù)鑒別。由于動(dòng)物類藥材含有大量蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物，因此應(yīng)用電泳技術(shù)對(duì)動(dòng)物類藥材進(jìn)行鑒定是行之有效的。劉興國等［10］采用高效毛細(xì)管電泳法對(duì)螞蝗及其混淆品菲牛蛭進(jìn)行蛋白多肽的分析，結(jié)果螞蝗與菲牛蛭的高效毛細(xì)管電泳圖譜之間有明顯差異，重復(fù)性及精確度良好 ，能快速準(zhǔn)確地鑒別。

2 中藥有效成分測定

HPCE法可用于多種中藥有效成分的分離和含量測定，如生物堿、黃酮類、苷類、有機(jī)酸類、醌類、酚類及香豆素類等。

2.1 生物堿類 生物堿在緩沖體系中大多帶有部分正電荷，一般可用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)模式。朱金花等［11］采用膠束電動(dòng)色譜中大體積進(jìn)樣法分離測定蓮子心中的蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿，多種生物堿分離結(jié)果良好。

2.2 黃酮類 黃酮類化合物有很多重要的生理活性，廣泛存在于植物中。王敬鵬等［12］采用化學(xué)發(fā)光法測定槐米中蘆丁和槲皮素的含量，具有分析時(shí)間短、樣品前處理簡便、進(jìn)樣量少、有機(jī)溶劑消耗少及操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。

2.3 蒽醌類 蒽醌類化合物結(jié)構(gòu)中多有羥基和羧基，用CZE和MECC都能分析，如分離大黃中5種蒽醌類化合物，并測定掌葉大黃、唐古特大黃和藏邊大黃中的蘆薈大黃素、大黃素和大黃酸的含量。

2.4 苷類 在苷類及其他藥物的分離分析方面，曾振興等［13］測定龍膽炮制前后龍膽苦苷的含量變化，結(jié)果表明龍膽經(jīng)過炮制后龍膽苦苷的含量出現(xiàn)降低，但降低幅度存在較大差異，其原因?yàn)辇埬懪谥七^程中，溫度不易控制恒定，導(dǎo)致炮制效果不同，龍膽苦苷的損失程度也不同。

2.5 含有機(jī)酸類藥材 有機(jī)酸成分解離后帶負(fù)電荷，以CZE模式分析時(shí)，在中性成分后出峰，分析時(shí)間較長。蒜氨酸是大蒜中重要的生物活性物質(zhì)，是大蒜素的前體。馬曉麗等［14］研究采用高效毛細(xì)管電泳法測定大蒜中蒜氨酸含量，試驗(yàn)中配制了不同pH值的磷酸緩沖液，用以考查pH值對(duì)分離效果的影響。隨著pH值的增大，保留時(shí)間延長，選用pH值為6.0的緩沖液，分離時(shí)問短，峰形佳。石雪等［15］采用毛細(xì)管電泳－電化學(xué)檢測(CE－ED)法，對(duì)不同品種竹葉和竹葉茶中的活性成分香蘭素、香草酸、順式阿魏酸、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸和對(duì)香豆酸同時(shí)進(jìn)行定性定量分析，為不同品種竹葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

2.6 含蛋白質(zhì)多肽類藥材 這類化合物在除等電點(diǎn)以外的pH值條件下帶有電荷，因而可以用CZE模式來分離測定。阮桂平等［16］研究表明冬蟲夏草中化學(xué)成分的高效毛細(xì)管電泳研究主要集中在冬蟲夏草中多糖類、蛋白質(zhì)和核苷類物質(zhì)。定性方面主要是應(yīng)用高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜鑒別冬蟲夏草，定量方面主要是對(duì)冬蟲夏草中核苷成分進(jìn)行研究。

2.7 含多糖類藥材 王艷杰等［17］實(shí)驗(yàn)采用Beckman MDQ型高效毛細(xì)管電泳儀對(duì)純化后的五味子多糖進(jìn)行單糖組分的分析，通過五味子多糖圖譜與混合單糖圖譜的比較，可以鑒別出大部分單糖的組成成分，為今后進(jìn)一步深入研究五味子多糖提供實(shí)驗(yàn)參考。

3 中藥復(fù)方制劑的成分分析

中藥復(fù)方制劑由多種藥材組成，成分復(fù)雜。目前控制其質(zhì)量的方法是測定其中一種或多種主要活性成分的含量，常用的分析手段是HPLC。在HPCE成功地用于中藥材成分分析以后，很多分析工作者對(duì)多種成分的同時(shí)測定進(jìn)行了深入研究。如羅敏等［18］測定了戊己丸中鹽酸小檗堿與芍藥苷的含量，考查了《中國藥典》法、冷浸法和超聲法對(duì)鹽酸小檗堿和芍藥苷提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)冷浸法提取的含量最低，超聲提取與《中國藥典》法提取含量相差不大，由于《中國藥典》法的步驟煩瑣，故選用甲醇超聲提取的方法。劉丹等［19］測定一清顆粒中7種成分的含量，方中大黃的活性成分是蒽醌類化合物，黃芩含有黃酮成分，黃連的有效成分為小檗堿等生物堿。鑒于化合物為弱酸性多羥基化合物，應(yīng)選擇堿性緩沖體系。硼酸鹽能與多羥基化合物形成配位鍵，增加負(fù)電性，是分離這幾種物質(zhì)的良好體系。

4 中藥安全控制

4.1 毒性成分質(zhì)量控制 桂附地黃丸為傳統(tǒng)中藥制劑，由肉桂、附子、熟地黃、山茱萸等8味中藥組成，具有溫補(bǔ)腎陽的作用，臨床上主要用于治療腰膝酸軟，肢冷尿頻。方中附子含有痕量成分烏頭堿，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)其具有抗炎、免疫抑制、麻醉止痛、抗腫瘤、降血壓等作用。但烏頭堿的毒性很強(qiáng)，人口服烏頭堿0.2 mg即可出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭暈、眼花、脈緩、呼吸困難、神志不清和心律紊亂等中毒現(xiàn)象。然而，由于目前附子沒有統(tǒng)一的炮制方法，因此，為控制藥品質(zhì)量，保證用藥安全，李琚沫等［20］采用毛細(xì)管電泳法對(duì)桂附地黃丸中痕量毒性成分烏頭堿進(jìn)行質(zhì)量控制。

4.2 非法添加化學(xué)成分 李陽等［21］采用毛細(xì)管電泳法同時(shí)測定減肥類功能食品中7種違禁成分，建立的CE檢測方法快速、簡便，溶劑用量少，檢測限符合檢測要求，可作為快速打假的一種手段。

5 中藥指紋圖譜

中藥制劑成分復(fù)雜，目前其質(zhì)量控制的方法多是測定其中一種或幾種指標(biāo)成分的含量，但這種方法不能完全體現(xiàn)出中藥制劑的整體質(zhì)量，在尚不清楚全部化學(xué)成分的情況下，通過色譜、光譜、波譜、質(zhì)譜等儀器分析所得物質(zhì)群指紋圖譜展現(xiàn)了這種可能性。目前指紋圖譜已成為國際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量最有效的手段。孫國祥［22］等采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法建立了復(fù)方丹參滴丸的指紋圖譜，具有較好的精密度和重現(xiàn)性，為復(fù)方丹參滴丸制劑的質(zhì)量控制提供了檢測方法。時(shí)存義等［23］建立黃芩的毛細(xì)管電泳指紋圖譜，并對(duì)黃芩苷進(jìn)行含量測定，結(jié)果表明不同產(chǎn)地黃芩中黃芩苷含量有明顯差異，為黃芩藥材質(zhì)量控制提供了新方法。

高效毛細(xì)管電泳以其高效、快速、簡便且柱不易受污染的特點(diǎn)而優(yōu)于HPLC法，在中藥有效成分的分離、定性定量及中藥材鑒別等方面應(yīng)用越來越廣泛。此外，HPCE法可與其他進(jìn)樣技術(shù)(如流動(dòng)注射)聯(lián)用，不但可提高測定精度，而且能完成連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣及在線分析，方便大批量樣品的測定，或采用CE－MS、CENMR及CE－MS－MS的聯(lián)用技術(shù)，充分利用HPCE的高分離效率和Ms或NMR的高靈敏度與定性鑒定能力，快速完成眾多復(fù)雜成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定，大大提高和拓寬CE的性能和應(yīng)用范圍，更適用于中藥復(fù)雜化學(xué)成分的分離與測定?？梢灶A(yù)見，HPCE在中藥制劑質(zhì)量控制及中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中必將發(fā)揮巨大作用。

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