胸腺肽α1對(duì)80歲以上老年人外周血樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)及功能的影響

張興虎 錢曉明 齊玉琴 萬文輝 趙東寶

樹突狀細(xì)胞(DC)是已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的一類抗原提呈細(xì)胞(APC)，其最大的特點(diǎn)就是能有效刺激原始T細(xì)胞，誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答，也能促進(jìn)B細(xì)胞生成抗體及自然殺傷(NK)細(xì)胞的激活，處于機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)［1-3］。應(yīng)用粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素4(IL-4)體外可以誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞生成DC(MoDC)，并具有極強(qiáng)的刺激T細(xì)胞增殖的能力［4-5］。而胸腺肽α1是一種具有多種效應(yīng)的免疫增強(qiáng)劑，其除了可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的能力外，還可以明顯促進(jìn)同種T細(xì)胞的增殖［6］。本研究主要是觀察≥80歲老年人在應(yīng)用胸腺肽α1后，外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)所得到的DC生長、活力、存活時(shí)間及刺激T細(xì)胞增殖情況的改變。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備DC培養(yǎng)基CellGro-DC購自德國CellGenix公司;rhGM-CSF、rhIL-4購自上海飛捷公司;絲裂霉素C購自日本Kyowa Hakko kogyo公司;淋巴細(xì)胞分離液購自天津TBD公司;DMSO購自美國Sigma公司;倒置顯微鏡(Zeiss Axiovert 40)、MTT(噻唑藍(lán))購自上海生工公司。

1.2 試驗(yàn)對(duì)象選取老年人30例，年齡80～96歲，平均(85.6±4.5)歲，其中男22例，女8例。排除腫瘤、糖尿病、慢性感染、自身免疫性疾病、服用免疫抑制劑，并未接受過免疫增強(qiáng)劑的治療。

1.3 治療方法給予胸腺肽α1注射劑1.6 mg皮下注射，每周2次，療程為1月。

1.4 DC體外培養(yǎng)在治療前后分別將新鮮的抗凝外周血各20 ml，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心(20℃，400 g，20 min)，取界面細(xì)胞，放入50 ml離心管中，用PBS懸浮細(xì)胞，離心(200 g，10 min)洗細(xì)胞3次，用Cell-Gro-DC培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，加入24孔板，每孔2.5×106細(xì)胞/ml培養(yǎng)基，置37℃、5%二氧化碳孵箱(Thermo-Forma)培養(yǎng)2 h后，吸棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基輕輕洗培養(yǎng)板去除非貼壁細(xì)胞，即獲得貼壁的單核細(xì)胞，每孔加1 ml CellGro-DC樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基，rhGM-CSF 100 ng/ml，rhIL-4 4500 U/ml，置37℃、5%二氧化碳孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天每孔補(bǔ)加上述培養(yǎng)基1 ml及細(xì)胞因子，培養(yǎng)第7天收集懸浮細(xì)胞，即為DC。

1.5 DC形態(tài)觀察通過倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞活力、數(shù)量及形態(tài)變化。

1.6 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)首先用淋巴細(xì)胞分離液分離正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，置37℃培養(yǎng)2 h后去除貼壁細(xì)胞，非貼壁細(xì)胞用10%AB血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液懸浮，制備獲得同種淋巴細(xì)胞，96孔板每孔加入同種淋巴細(xì)胞5×105。DC用含10%AB血清的RPMI 1640懸浮為5×106細(xì)胞/ml，加入絲裂霉素C 25 μg/ml，37℃孵育45 min，RPMI液洗3次，用含10%AB血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按DC∶T細(xì)胞不同比例(1∶10，1∶30，1∶90，1∶270)，將滅活的DC加入96孔板中與同種異體T淋巴細(xì)胞混合，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，終體積為200 μl，另取3孔只加淋巴細(xì)胞而不加DC細(xì)胞，作為背景對(duì)照。置于37℃、5%二氧化碳孵箱培養(yǎng)96 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)孵育4 h，1500 r/min，離心5 min，吸去孔內(nèi)液體，每孔加DMSO 200 μl，震蕩搖勻后在37℃放置0.5 h待甲臢結(jié)晶完全溶解后，用自動(dòng)光譜測讀儀(molecular device)測定光密度(A)值(570 nm)，結(jié)果用3孔均值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)比較治療前后的差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC體外培養(yǎng)生成的情況通過對(duì)≥80歲老年人胸腺肽α1治療前后外周血DC體外培養(yǎng)的觀察，發(fā)現(xiàn)治療前DC在培養(yǎng)過程中細(xì)胞逐漸死亡，培養(yǎng)孔中的細(xì)胞量逐漸較少，培養(yǎng)至第7天部分細(xì)胞死亡，留有少量單核樣細(xì)胞及懸浮的樹突狀形態(tài)的細(xì)胞，最終獲得的DC數(shù)量較少(圖1A)，其中有8例未能培養(yǎng)出DC。而治療后培養(yǎng)細(xì)胞的活力保持較好，至第7天全部獲得數(shù)量較多的DC(圖1B)。

圖1 體外培養(yǎng)第7天時(shí)生成DC的形態(tài)(×100)

2.2 DC的體外存活時(shí)間培養(yǎng)至第7天獲得的DC體外繼續(xù)培養(yǎng)，治療前DC繼續(xù)培養(yǎng)2 d后全部死亡，而治療后DC體外繼續(xù)培養(yǎng)可以保持存活5～7 d。

2.3 同種T淋巴細(xì)胞刺激能力測定刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖能力的高低直接反映了DC的功能狀況。治療前DC刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖能力較弱，在刺激細(xì)胞：反應(yīng)細(xì)胞(S∶R)比值為1∶10時(shí)A值為0.79±0.11，而治療后A值為1.23±0.22，治療前后具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

3 討論

DC在先天性和獲得性免疫中扮演了重要的角色。DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)和最活躍的專職APC，體內(nèi)分布廣泛，亞群復(fù)雜，能捕獲、處理和提呈抗原，并參與淋巴細(xì)胞激活、生長和分化，在天然免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮著極其重要的作用，它是識(shí)別病原體侵入的第一道防線。機(jī)體的免疫識(shí)別首先由DC捕獲、加工和處理抗原，再將抗原提呈給T、B淋巴細(xì)胞，從而引發(fā)一系列免疫應(yīng)答，在體內(nèi)發(fā)揮強(qiáng)大的免疫監(jiān)視功能。

增齡引起的DC功能的下降減弱了機(jī)體免疫防御及免疫監(jiān)視作用，致使老年人容易患感染、腫瘤和自身免疫性疾病。老年人DC攝取抗原能力的下降減弱了它對(duì)抗原的加工和提呈，進(jìn)而也影響了它激活T細(xì)胞的能力。然而目前人們對(duì)DC在免疫衰老中所起的作用還不是十分清楚。

胸腺肽α1是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，能誘導(dǎo)T細(xì)胞的分化，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群發(fā)育并活化等各種免疫效應(yīng)，臨床上主要用于免疫缺陷癥和自身免疫性疾病的治療。本研究從另一途徑研究其對(duì)機(jī)體免疫增強(qiáng)作用。有實(shí)驗(yàn)研究表明直腸腫瘤小鼠模型接受胸腺肽α1加IL-2治療后，其外周血單核細(xì)胞的數(shù)量明顯增多［7］，≥80歲老年人較普通老年人外周血培養(yǎng)的DC體外的生長活力、T細(xì)胞刺激能力明顯降低［8］。本研究顯示，≥80歲老年人應(yīng)用胸腺肽α1后DC的活力和對(duì)同種T淋巴細(xì)胞的增殖作用明顯增強(qiáng)，可能的原因就是胸腺肽α1增強(qiáng)了外周血單核細(xì)胞的活性和(或)增多了其數(shù)量，具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。文獻(xiàn)中尚沒有血型對(duì)DC刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖能力有影響的相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胸腺肽α1治療后高齡老年人DC的體外培養(yǎng)存活時(shí)間延長，細(xì)胞活力明顯上升，培養(yǎng)獲得的DC數(shù)量明顯增多，刺激同種異體T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力也出現(xiàn)了一定程度的上升。

當(dāng)今世界人口老齡化是一個(gè)發(fā)展趨勢，并且≥80歲老年人群在老年人群中所占的比例越來越大，≥80歲老年人的免疫功能低下致使感染性疾病的發(fā)病率明顯增加，已嚴(yán)重影響了他們的生命質(zhì)量，如何減少感染性疾病的發(fā)生率，提高他們的生活質(zhì)量已成為當(dāng)今老年病學(xué)的一個(gè)重要的研究課題。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究老年免疫衰老的發(fā)病機(jī)制及有效干預(yù)提供了一個(gè)可靠的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

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