兩種基于恒定鏈活性片段載體在增強(qiáng)抗體分泌中作用的比較①

孟凡濤 陳芳芳 余為一 (安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036)

兩種基于恒定鏈活性片段載體在增強(qiáng)抗體分泌中作用的比較①

孟凡濤 陳芳芳 余為一 (安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036)

目的:比較基于恒定鏈片段的兩種載體的免疫效果和作用機(jī)理。方法:分別構(gòu)建了含新城疫病毒抗原表位F306和Ii不同片段的三個(gè)嵌合體(Ii-key/F306、Ii-key/F306/ND(兩個(gè)氨基酸殘基)和用抗原表位取代Ii-CLIP的Ii/F306)，經(jīng)純化后的融合蛋白免疫小鼠，并用ELISA檢測其抗體效價(jià)。同時(shí)嵌合體與Mhc共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，觀察兩者的細(xì)胞定位與結(jié)合。結(jié)果:Ii-key/F306免疫組比單獨(dú)F306抗原肽免疫組的抗體效價(jià)提高2倍，Ii-key/F306/ND免疫組增至4倍，而Ii-F306免疫組只增強(qiáng)2.5倍。在與Mhc共轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞和免疫共沉淀中，Ii-key/F306和Ii-key/F306/ND既沒有與MHCⅡ分子的膜共定位作用，也不能與后者結(jié)合;而Ii-F306卻能與MHCⅡ分子在漿膜共定位，并與后者結(jié)合。結(jié)論:這些結(jié)果表明，嵌合體都具有增強(qiáng)免疫效果的作用，并提示Ii片段促進(jìn)了抗原肽與MHCⅡ分子結(jié)合。

恒定鏈;抗體;共定位;MHCⅡ類分子

MHCⅡ分子在提呈外源性抗原中起重要作用。Ii與MHCⅡ αβ鏈結(jié)合形成αβIi復(fù)合物，分布在B細(xì)胞表面和樹突狀細(xì)胞表面[1，2]。Ii的 CLIP片段結(jié)合MHCⅡ分子的肽結(jié)合區(qū)(PBR)，防止自身多肽結(jié)合MHCⅡ分子[3-5]。在未成熟的溶酶體，Ii鏈被酶解，其CLIP區(qū)被外源性抗原肽取代[6]。體外的研究表明，純化的αβIi經(jīng)半胱氨酸蛋白酶處理后，組織蛋白酶B可解離Ii，同時(shí)形成游離α/β二聚體。這些解離的α/β具有結(jié)合多肽的能力[7]。在核磁共振光譜中，MHCⅡ分子與Ii-CLIP的結(jié)合是一個(gè)從常規(guī)到反線性的互變的動態(tài)過程。X衍射結(jié)晶表明，MHC的保守殘基和肽骨架形成以兩種形態(tài)的氫結(jié)合網(wǎng)。酶促反應(yīng)可加快這種MHC-CLIP結(jié)合的兩種形態(tài)的轉(zhuǎn)變以阻止抗原肽的進(jìn)入[8]。

近年來，Ii作為免疫載體促進(jìn)免疫應(yīng)答[9]。一是將抗原肽取代Ii的CLIP，不僅可增強(qiáng)抗感染免疫，還可以改變異常免疫應(yīng)答的性質(zhì)[10，11];二是利用Ii-key結(jié)構(gòu)的免疫活性，即恒定鏈跨膜區(qū)與CLIP區(qū)N端相連的四個(gè)氨基酸序列(LRMK)，與抗原肽連接形成的嵌合體，具有增強(qiáng)免疫效果的功能[12]。Ii-key結(jié)構(gòu)在核酸疫苗和多肽疫苗中得到應(yīng)用[13，14]。本研究比較了這兩種載體的免疫效果，探索了它們在細(xì)胞的定位和作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 基因片段的克隆與嵌合體、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖1 含Ii片段和抗原表位的嵌合體示意圖Fig.1 A schematic diagram of the hybrids containing Ii segments and antigen peptides F306

首先，以新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) F蛋白的cDNA為模板[15]，用重疊延伸方法構(gòu)建了一個(gè)含3個(gè)表位的抗原表位，命名為F306(圖1)。然后以本實(shí)驗(yàn)室保存的小鼠Ii鏈為模板[16]，用同樣的方法構(gòu)建含不同Ii功能區(qū)域的Ii-F306嵌合體片段(圖1)。最后將它們分別克隆到真核表達(dá)載體pmCherry-C1中以研究這些表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的定位。并將H2-Aa和H2-Ab基因(表1)克隆到帶有綠色熒光標(biāo)簽蛋白(GFP)的真核載體pEGFP-N1中。同時(shí)，為研究其免疫特性將相應(yīng)嵌合體插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1和pET-32a。在免疫共沉淀中，將H2-Ab插入真核載體PCMV-Myc。所有自行設(shè)計(jì)的引物見表1。構(gòu)建的質(zhì)粒(如圖1所示)送上海生工測序鑒定。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與激光共聚焦顯微鏡觀察COS7細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞置含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)。用脂質(zhì)體2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)用適量的DMEM培養(yǎng)基鋪細(xì)胞，至轉(zhuǎn)染前達(dá)到50% ～80%的鋪板量。轉(zhuǎn)染時(shí)，先將一定比例的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染Buffer充分混合，10分鐘后加入一定量的脂質(zhì)體2000，室溫放置30分鐘后輕輕的滴加到細(xì)胞板中。培養(yǎng)4～6小時(shí)后棄轉(zhuǎn)染液，換成正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，把甲醛固定的細(xì)胞片放置在倒置顯微鏡下用油鏡觀察表達(dá)物在細(xì)胞內(nèi)的位置。紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的吸光值分別是488 nm和515 nm。

表1 引物、恒定鏈片段與重組質(zhì)粒Tab.1 1 Primers，cloned Ii-segments and recombinants

1.3 免疫共沉淀與免疫印跡 將各種含Ii片段和F306的嵌合體(Ii/GFP，Ii-F306/GFP，Cyt/Tra/Iikey/F306/DN/GFP，Cyt/Tra/Ii-key/F306/GFP or Iikey/F306/DN/GFP)與H2-Aa/AH或者H2-Ab/Myc共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，鋪板和轉(zhuǎn)染方法同上。48小時(shí)后進(jìn)行免疫共沉淀。免疫共沉淀步驟按照試劑盒(Roche公司)說明操作。將最終獲得的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，采用半干轉(zhuǎn)移式將蛋白由PAGE膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。結(jié)合到膜上的蛋白用10%小牛血清封閉，與Myc單抗進(jìn)行過夜孵育。洗滌后與標(biāo)記有辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠二抗孵育2小時(shí)后再次充分洗滌，最后 ECL發(fā)光顯色分析。

1.4 嵌合體抗原的表達(dá)和純化 將攜帶原核表達(dá)載體pGEX-4T-1和pET32a的F306和F306嵌合轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Rosetta進(jìn)行IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)的蛋白經(jīng)鎳柱純化。純化的蛋白經(jīng)液相色譜(HPLC)純度檢測達(dá)到90%以上。以質(zhì)粒pGEX-4T-1表達(dá)的蛋白為免疫蛋白，以質(zhì)粒pET32a表達(dá)的蛋白為ELISA檢測蛋白。

1.5小鼠免疫、抗體檢測和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 10周齡BALB/c雌鼠，購自于安徽醫(yī)科大學(xué)，免疫蛋白的劑量為50 μg/只。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組為3只，陰性對照注射生理鹽水。常規(guī)免疫4周后經(jīng)眼球采血，收集血清，于 -20℃保存?zhèn)溆?。?F306為抗原，包被ELISA板進(jìn)行抗體免疫檢測，每個(gè)樣品重復(fù)3孔。以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠為二抗，最后以鄰苯二胺(OPD)顯色反應(yīng)。室溫放置15分鐘左右后終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀在409 nm波段測吸光值。數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 活性片段與質(zhì)粒的構(gòu)建及其鑒定 首先，分別從鼠外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)提取 mRNA，經(jīng) RT-PCR 獲得 MHCⅡα、β和恒定鏈基因片段。經(jīng)測序比對鑒定(圖2)后，將MHCⅡ類分子α和β鏈基因片段分別插入質(zhì)粒 pEGFP-N1(表1)。

圖2 擴(kuò)增和重組的DNA片段鑒定Fig.2 Identification of the amplified and reconstructed DNA segments

其次，從恒定鏈全長基因經(jīng)大引物擴(kuò)增，將抗原肽基因片段替代CLIP，構(gòu)建嵌合體Ii/F306(圖2)。再用相應(yīng)引物(表1)獲得嵌合體Ii-key/F306和Iikey/F306/DN(圖2)。

最后將上述片段分別插入質(zhì)粒pmCherry-C1，構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒(表1)，用于轉(zhuǎn)染COS7;插入原核質(zhì)粒pGEX-4T-1和pET-32a，用于轉(zhuǎn)染大腸桿菌表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行切膠純化用于免疫動物。GST蛋白的分子量約為26 kD，GST/F306融合蛋白的分子量預(yù)期約為35.8 kD;GST/Ii-key/F306為 36.2 kD;GST/Ii-key/F306/DN 為 36.4 kD; GST/Ii/F306(F306替代 CLIP)為 57.9 kD。His/ F306為ELISA檢測中包被抗原。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在預(yù)期大小處有相應(yīng)的蛋白條帶(圖3)。2.2 恒定鏈活性片段誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答分析 檢測恒定鏈活性片段在抗原肽誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答中的作用，發(fā)現(xiàn)用F306取代CLIP的Ii-F306免疫組產(chǎn)生的血清抗體效價(jià)比單獨(dú)F306抗原肽免疫組高2.5倍;用Ii-key/F306免疫組增強(qiáng)約2倍，而Ii-key/F306/ DN則增強(qiáng)達(dá)4倍(圖4)，這說明CLIP的C端的殘基也具有功能。

圖3 純化的嵌合體蛋白鑒定Fig.3 Identification of the purified hybrid proteins

圖4 Ii活性片段增強(qiáng)小鼠特異性抗體產(chǎn)生的作用Fig.4 Effect of the Ii active segments on specific antibody production in the BALB/c mice

圖5 Ii和嵌合體在COS7細(xì)胞中的定位(×1 000)Fig.5 The location of Ii and the Ii hybrids in COS7 cells (×1 000)

圖6 Ii和嵌合體在COS7細(xì)胞中與MHCⅡ分子的共定位(×1 000)Fig.6 The co-location of Ii or the Ii hybrids with MHC Ⅱmolecule in COS7 cells(×1 000)

2.3 活性片段在細(xì)胞的定位 為明確這兩個(gè)恒定鏈活性片段在真核細(xì)胞的定位，分別用重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。由圖5可見:恒定鏈作為跨膜蛋白，表達(dá)和定位于細(xì)胞漿膜(圖5，左)，用F306替代CLIP的Ii-F306也保持了恒定鏈的細(xì)胞膜定位(圖5右);而Ii-key/F306片段則沒有胞膜定位的作用(圖5，中)。

圖7 Ii和嵌合體與MHCⅡ β鏈的結(jié)合Fig.7 Binding of Ii or the Ii hybrids to MHC Ⅱ β chain

2.4 活性片段與MHCⅡ分子在細(xì)胞的共定位 為了解含恒定鏈活性片段的嵌合體與MHCⅡ分子的關(guān)系，將這些重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，并用激光共聚焦顯微鏡觀察。MHCⅡα/β鏈和Ii鏈以及嵌合體分別由GFP和RFP標(biāo)記，當(dāng)兩種相關(guān)蛋白分子在細(xì)胞相同部位表達(dá)共定位，就會形成橙色熒光，否則仍保持各自熒光顏色。圖6的結(jié)果表明，MHCⅡα鏈和β鏈都能與Ii鏈或Ii-F306在胞漿膜共定位，而Ii-key/306卻不能與胞漿膜上的MHCⅡ共定位。2.5活性片段與MHCⅡ分子的結(jié)合特性 為證實(shí)胞膜上共定位的MHCⅡ分子與Ii或Ii嵌合體是兩者穩(wěn)定結(jié)合形成復(fù)合體的結(jié)果，進(jìn)一步用共轉(zhuǎn)染的產(chǎn)物進(jìn)行免疫共沉淀和免疫印跡。結(jié)果如圖7所示，Ii鏈和Ii-F306能夠與MHCⅡ結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，而Ii-key/F306則不能與MHCⅡ分子結(jié)合。

3 討論

首先，Ii-key和用抗原肽取代CLIP的Ii都具有明顯的增強(qiáng)小鼠產(chǎn)生特異性抗體水平的作用?？乖呐cMHCⅡ分子不是特異性的結(jié)合，而是基于異體識別的兼容性的結(jié)合。MHCⅡ分子的肽結(jié)合槽是與抗原肽結(jié)合的部位。研究表明，MHCⅡ構(gòu)象是重要的決定因素[17]，而抗原肽也是決定MHCⅡ構(gòu)象改變的因素[18]。在初始條件下，MHCⅡ以“松弛性”構(gòu)象增加抗原肽進(jìn)入能力;而一旦抗原肽進(jìn)入MHCⅡ，則形成“緊密性”構(gòu)象[19]。由于 Ii鏈具有結(jié)合MHCⅡ分子的結(jié)構(gòu)特性，而CLIP區(qū)正是進(jìn)入肽結(jié)合凹槽的區(qū)段，所以不僅用抗原肽取代CLIP的Ii鏈嵌合體，而且與CLIP的N端連接Ii-key四個(gè)氨基酸，都可以易化抗原肽進(jìn)入凹槽而改變MHCⅡ的構(gòu)象?；谶@種可能，本研究除了將抗原肽與Iikey連接外，還連接了CLIP的C端兩個(gè)氨基酸DN (Asn-Asp)，以進(jìn)一步增強(qiáng)這種作用。結(jié)果表明與CLIP的N端和C端連接的片段均具有明顯增強(qiáng)抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的作用，其機(jī)理可以推測為促進(jìn)了抗原肽進(jìn)入和結(jié)合MHCⅡ分子凹槽。然而，由于Ii-key/F306和Ii-key/F306/ND均不能與MHCⅡ分子結(jié)合(圖7)，提示它們?nèi)圆蛔阋耘cMHCⅡ分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物?？偠灾狙芯拷Y(jié)果表明，CLIP的C端兩個(gè)氨基酸DN與Ii-key四個(gè)氨基酸殘基一樣，也可以作為增強(qiáng)免疫的功能基團(tuán)。

其次，Ii鏈的跨膜區(qū)和胞漿區(qū)具有膜定位的功能，而且完整的Ii鏈還含有與MHCⅡ結(jié)合的三聚體區(qū)。所以，Ii鏈和用抗原取代CLIP的Ii-F306嵌合體，都能與MHCⅡ分子的α或β鏈在細(xì)胞膜共定位，而含有Ii-key結(jié)構(gòu)的嵌合體卻沒此有功能(圖7)。盡管Ii-key/F306/DN和Ii-F306都有增強(qiáng)機(jī)體產(chǎn)生抗體的功能，但是，推斷這兩者的作用主要通過協(xié)助MHCⅡ分子，通過結(jié)合MHCⅡ結(jié)合槽的可變構(gòu)象外的位點(diǎn)，構(gòu)象的改變使之更易于抗原表位的進(jìn)入[20]，而與在細(xì)胞膜的定位無關(guān)。

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[收稿2012-03-03 修回2012-05-14]
(編輯 張曉舟)

Comparison of effect of two vector based on invariant chain segments on the increasing antibody production

MENG Fan-Tao，CHEN Fang-Fang，YU Wei-Yi.Key Laboratory of Zoonoses of Anhui Province，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China

Objective:To compare the effects of two vectors based on invariant chain(Ii)segments on the immune response.MethodsThree hybrids containing NDV epitope F306 and Ii segments，Ii-key/F306，Ii-key/F306/ND(two residues)and Ii/F306 in which CLIP was replaced by epitope F306，were reconstructed respectively.BALB/c mice were immunized with the purified fusion proteins and the antibody titers were detected with ELISA respectively.Meanwhile the hybrids and Mhc were co-transfected in COS7 cells to observe their location and binding.ResultsThe groups immunized with Ii-key/F306 or Ii-key/F306/DN had two-fold or four-fold higher antibody titers than that immunized with F306 alone respectively，but the group immunezed with Ii-F306 enhanced only two and a half-fold higher antibody titers.In the co-transfected COS7 cells，neither Ii-key/F306 nor Ii-key/F306/DN could co-locate on the plasma membrane or bind with MHC classⅡ molecule.However，Ii-F306 could co-locate and bind with MHC classⅡ molecule.ConclusionThese results showed that these hybrids could increase the immune response and suggested that Ii segments improved binding of the epitope to MHC classⅡ molecule.

Invariant chain(Ii);Antibody;Co-location;MHC classⅡ molecule

S855.3

A

1000-484X(2012)08-0728-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.012

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31172306)

孟凡濤(1988年-)，男，在讀碩士，主要從事微生物與免疫學(xué)方面研究;

及指導(dǎo)教師:余為一(1952年-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物與免疫學(xué)方面研究，E-mail: yuweiyi@ahau.edu.cn。