氟化鈉對小鼠睪丸組織的損傷及細胞凋亡的影響

趙燕凌，張 斌，宋國華，劉茂林，高繼平

（1.山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像系，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，太原 030001）

氟作為機體生命活動所必需的微量元素之一，它廣泛存在于飲水、土壤、大氣和動植物體內(nèi)，但機體長期過量攝入可導(dǎo)致慢性氟中毒。氟對雄性生殖系統(tǒng)有毒性作用，可直接作用于睪丸、附睪、前列腺等，破壞其結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生育能力的下降［1］。研究表明間質(zhì)細胞受損，線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化顯著，可能通過增強脂質(zhì)過氧化作用，抑制物質(zhì)和能量代謝過程，損傷DNA等途徑對雄性生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能造成直接損害［2］。氟對雄性生殖系統(tǒng)的損害是多途徑、十分復(fù)雜的過程，關(guān)于氟致睪丸間質(zhì)細胞凋亡作用和機制仍不十分清楚［3］。因此，氟對雄性生殖系統(tǒng)的影響日益受到重視。

本研究選用小鼠建立氟染毒模型，對氟染毒小鼠睪丸組織的結(jié)構(gòu)和組織凋亡進行分析，觀察氟對小鼠睪丸組織病理學(xué)變化，用TUNEL技術(shù)檢測睪丸組織細胞凋亡，探討氟引起睪丸組織損傷和凋亡的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

動物：健康雄性昆明小鼠40只，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（SCXK［晉］2009-001）。

試劑：氟化鈉（NaF，分析純，購自天津化學(xué)試劑廠）；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（北京中昊生物公司）；4％多聚甲醛。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立

雄性昆明小鼠40只常規(guī)飼養(yǎng)1周后，隨機分為四組：對照組、低氟組、中氟組和高氟組，每組10只。根據(jù)已發(fā)表文獻［4，5］對實驗組給藥劑量和用藥時間稍作修改，對照組飼喂普通飼料，飲去離子水；低氟組、中氟組和高氟組飼喂普通飼料，分別飲用含10，25，50 mg/L氟化鈉去離子水。定時飼喂飼料，自由采食、飲水。環(huán)境溫度20～25℃。實驗期間每天觀察動物活動、飲食、排泄、反應(yīng)及氟斑牙情況，同時每周稱重1次，觀察體重變化。

1.2.2 標本采集

飼喂120 d后，麻醉后解剖，迅速取其睪丸組織，生理鹽水沖洗，置于4％多聚甲醛固定液中固定24 h。

1.2.3 切片制作

睪丸組織在4％多聚甲醛中固定24 h后，自來水沖洗，去離子水沖洗，將睪丸組織用鋒利刀片沿縱向?qū)Π肭懈畛蓛蓧K，梯度酒精脫水，置二甲苯透明，較低溫度（低于60℃）下浸蠟，包埋。將包埋好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，厚度為5μm。將切片漂浮于45℃溫水中，然后用0.01％多聚賴氨酸處理過的載玻片撈起，并放在烘片機上烤干。

1.2.4 HE染色

按常規(guī)方法對組織切片作HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)變化。

二甲苯、酒精脫蠟至水→蘇木精染色10 min，鏡下控制鹽酸酒精分化，水洗返藍→脫水到90％酒精→伊紅5 min→梯度乙醇脫水（濃度：75％-80％-90％-100％）→二甲苯透明→中性樹膠封片→光鏡下觀察睪丸組織形態(tài)。

1.2.5 原位細胞凋亡檢測

采用 TdT介導(dǎo)的末端標記法（TdT-mediated dUTP nick end labelin，TUNEL法）進行細胞凋亡的原位檢測，按照試劑盒說明書進行。TUNEL結(jié)果計算：400倍高倍鏡下觀察，陽性細胞的細胞核呈棕黃色，細胞核出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒均為陽性細胞，凋亡細胞的形態(tài)學(xué)特征為染色質(zhì)濃集、核裂解以及核周新月體樣濃集染色質(zhì)，細胞內(nèi)可見深色凋亡小體者為凋亡細胞。隨機選擇5個高倍視野（400倍）并計數(shù)500個細胞，記錄凋亡細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)（AI）：AI=凋亡細胞數(shù)/500×100％。

1.2.6 統(tǒng)計分析

用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±S）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢查

染毒期間，對照組小鼠營養(yǎng)活動狀況良好，皮膚有彈性，被毛濃密有光澤，反應(yīng)活躍機敏，活動敏捷，對照組小鼠的體重隨染毒時間延長呈正增長。牙齒完整有光澤，釉質(zhì)棕黃色半透明。氟中毒組小鼠營養(yǎng)狀況較差，身體瘦弱，被毛蓬亂無光澤，反應(yīng)遲鈍。下切齒失去光澤，牙釉質(zhì)出現(xiàn)白堊樣不透明性改變，表面粗糙，變脆易磨損，長度為正常時的1/ 2，有的僅剩殘根。

2.2 病理剖檢

正常飼料對照組小鼠剖開腹腔后，可見皮下脂肪充盈，肌肉豐滿，內(nèi)臟器官檢查未見異常。

染氟組小鼠剖開腹腔后，可見皮下脂肪貧瘠，肌肉緊緊附著于骨，不易剝離，內(nèi)臟器官檢查見異常。

2.3 睪丸組織形態(tài)學(xué)的變化

實驗觀察到正常組睪丸間質(zhì)細胞，周圍有明顯較長突起，胞體扁橢圓形，細胞核正常，核染色質(zhì)分布均勻，胞質(zhì)中細胞器分布正常。用光鏡觀察染氟組睪丸細胞，小鼠曲精小管退化壞死，可見細胞排列紊亂，細胞皺縮、體積縮??；胞漿結(jié)構(gòu)疏松內(nèi)有水腫空泡，細胞內(nèi)器稀少，胞體核固縮，核染色質(zhì)凝集呈塊狀分布，染色質(zhì)邊集，核周出現(xiàn)空泡樣變化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹模糊不清（彩插3見圖1）。

2.4 睪丸組織凋亡檢測

顯微鏡鏡下觀察，凋亡細胞核特異性染色呈棕色，胞漿為淺棕色，非凋亡細胞為淺紫色（彩插3見圖2）。鏡下表現(xiàn)為細胞收縮變圓失去微絨毛，與鄰近細胞連接消失，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮邊集，出現(xiàn)細胞膜內(nèi)陷分割，并有膜包裹的凋亡小體形，TUNEL陽性細胞有的胞核略小，有的胞核呈碎片狀。氟中毒組引起大量TUNEL陽性細胞（彩插3見圖2）。與對照組比較，染氟組睪丸細胞凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 小鼠睪丸細胞凋亡率的比較Tab.1 Comparison of testis apoptosis in mouse

3 討論

3.1 高氟對動物組織的損傷

近年來氟化物對內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)功能的影響引起廣泛的重視，研究表明氟化物可引起小鼠和大鼠睪丸、腎近曲小管、肝臟、大腦皮質(zhì)細胞的組織學(xué)改變以及激素水平的變化。有報道氟中毒對大鼠腎近曲小管上皮細胞有明顯的渾濁腫脹和空泡變性，并伴有少量炎細胞浸潤，多數(shù)腎近曲小管管腔狹窄變形，局部出現(xiàn)壞死崩解。發(fā)現(xiàn)氟中毒能明顯誘導(dǎo)大鼠腎臟細胞凋亡，并存在壞死［6］。崔留欣等［7］關(guān)于氟致雄性大鼠生殖功能損害的實驗研究表明，染氟組的各級生精細胞數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)疏松，成熟精子的數(shù)量下降。郭曉英［8］關(guān)于氟對大鼠肝臟功能和形態(tài)的影響及與氧化應(yīng)激關(guān)系的實驗研究表明，染氟組大鼠肝細胞細胞界限不清，細胞內(nèi)染色質(zhì)濃縮、邊集，呈半月形聚集于核膜下；線粒體可見明顯腫脹，蠟斷裂或消失；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張；可見較多的白色脂滴；毛細膽管擴張，腔面微絨毛減少。不同日齡氟中毒三代大鼠大腦皮質(zhì)細胞凋亡程度增高，氟中毒可以引起世代蓄積，接觸氟環(huán)境時間越長，其動物子代大腦損傷越嚴重［9］。Schalz等［10］研究結(jié)果認為氟可抑制小鼠血清睪酮水平，使其比對照組下降40％，氟化物毒性與動物生殖力下降呈正相關(guān)。染毒組精子計數(shù)、活動率下降，畸形率升高，血清睪酮、促黃體生成激素下降。

本研究結(jié)果及以往報道都表明，高氟會導(dǎo)致小鼠曲精小管退化壞死，細胞排列紊亂，細胞皺縮、體積縮??；胞漿結(jié)構(gòu)疏松內(nèi)有水腫空泡，細胞內(nèi)器稀少，胞體核固縮，核染色質(zhì)凝集呈塊狀分布，染色質(zhì)邊集，核周出現(xiàn)空泡樣變化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹模糊不清。關(guān)于高氟對生殖系統(tǒng)毒作用機制的分子和基因水平的研究還有待于進一步探討。

3.2 染氟小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡

氟是一種原生質(zhì)毒物，可以誘導(dǎo)機體不同組織發(fā)生細胞凋亡。當前，細胞凋亡已成為分子生物學(xué)、胚胎學(xué)、放射生物學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)和血液學(xué)的研究熱點。許多外界不良因素可以誘導(dǎo)機體組織的細胞凋亡。細胞凋亡是指在基因調(diào)控下的細胞自主死亡，細胞以這種主動死亡來維持組織的自身穩(wěn)定。它在生物體的生長發(fā)育、衰老、組織損傷與修復(fù)以及病毒感染中都發(fā)揮重要的作用。

氟為細胞毒性物質(zhì)，近年來細胞凋亡在氟中毒發(fā)病機制中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注，人們已從多方面探討了氟化物誘導(dǎo)細胞凋亡的作用機制。已有研究表明，高氟對多種組織細胞的損傷不伴有炎癥反應(yīng)，而以核內(nèi)染色質(zhì)邊集、細胞萎縮的改變?yōu)樘卣鳎伺c眾多學(xué)者對細胞凋亡的描述相吻合［11］，提示細胞凋亡可能是氟致機體組織細胞損傷的重要參與因素。結(jié)構(gòu)改變是不可逆的，其損害的程度與體內(nèi)氟負荷密切相關(guān)。但氟究竟是如何引起睪丸病理改變、導(dǎo)致生殖功能損害目前不清楚。

TUNEL實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應(yīng)細胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。細胞凋亡的生化特征之一，是Ca2+、Mg2+離子依賴的內(nèi)源性核酸酶的激活將核染色體從核小體間斷裂，形成由大約為180～200 bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段，從而產(chǎn)生有游離粘性3＇-OH的DNA斷鏈，因此可進行凋亡細胞的檢測，即脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法（term inal-deoxynucleotidyl transferasemediated nick end labeling，TUNEL）。TUNEL法是目前唯一具有普遍意義且已發(fā)展成熟的檢測方法，可實現(xiàn)末端定量，并可在形態(tài)學(xué)改變之前檢測到凋亡，且敏感、標記強度大［12］。根據(jù)實驗原理，TUNEL法較免疫組化法更加精確、敏感，在時序性上早于免疫組化法表達出細胞凋亡的特性，故本實驗考慮以TUNEL法的結(jié)果為準，推測氟中毒后對睪丸組織功能有明顯影響。

在氟中毒與細胞凋亡關(guān)系的研究中，國外學(xué)者主要采用體外細胞培養(yǎng)的方法進行實驗，觀察到培養(yǎng)肺細胞經(jīng)氟化物處理后 DNA的損害和凋亡改變［13］。Lowth［14］給體外培養(yǎng)的胰島 β細胞染氟以后，電鏡下觀察到染色質(zhì)邊集及DNA降解成寡聚核甘酸，呈現(xiàn)出凋亡特征。Lonroy［15］用氟化鋁處理胸腺小葉時，亦激起大范圍胸腺細胞亞型的凋亡。Hirano［16］培養(yǎng)骨肉瘤細胞UMR106株，用5 mmol/L氟處理8 h以后，用TUNEL法證明了細胞凋亡的存在。國內(nèi)學(xué)者以大體動物實驗發(fā)現(xiàn)過量氟可誘導(dǎo)組織細胞凋亡。呂曉紅［17］在慢性氟中毒大鼠觀察到腦細胞中DAB著染陽性的凋亡細胞，并且表達具有選擇性，流式細胞術(shù)顯示慢性氟中毒腦組織中的凋亡峰明顯高于正常對照組。應(yīng)用流式細胞術(shù)同樣檢測到氟中毒大鼠和家兔肝細胞凋亡率較對照組明顯增加［18，19］。實驗中 TUNEL檢測結(jié)果顯示：顯微鏡鏡下觀察，對照組細胞核呈現(xiàn)出淡紫色，染毒組細胞核呈現(xiàn)出棕黃色，TUNEL陽性細胞有的胞核略小，有的胞核呈碎片狀。氟中毒組引起大量TUNEL陽性細胞，而對照組大鼠罕見TUNEL陽性細胞。氟可促進睪丸組織細胞的過度凋亡及引起細胞壞死，且細胞凋亡率比同劑量同時間組細胞壞死率高。這提示細胞過度凋亡可能是氟誘發(fā)的睪丸組織細胞損傷的主要形式，細胞壞死則是細胞凋亡晚期的表現(xiàn)。氟誘發(fā)睪丸組織細胞損傷，可解釋氟可能對睪丸毒作用的機制，即氟通過誘發(fā)睪丸組織細胞過度凋亡而對睪丸造成功能性或器質(zhì)性損害。這也印證了氟對睪丸早期功能性損害的可逆性及晚期結(jié)構(gòu)性改變的不可恢復(fù)性。

本研究用病理學(xué)觀察、TUNEL的凋亡檢測，證明了氟染毒可導(dǎo)致小鼠睪丸組織細胞凋亡，提示過量氟在體內(nèi)的毒性和細胞凋亡有關(guān)，本結(jié)果為深入研究氟的雄性生殖毒性提供了資料。高氟對睪丸組織的損害存在細胞凋亡，其損害過程是一個復(fù)雜的過程，細胞凋亡還受到其他多種細胞凋亡基因的調(diào)控，如Caspase家族、一氧化氮、興奮性氨基酸、自由基等，各種因素在睪丸間質(zhì)細胞凋亡的過程發(fā)揮怎樣的相互作用，還需開展深入研究。

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