實驗動物運(yùn)輸盒微生物指標(biāo)檢測分析

張華瓊，趙 田，范方玲，羅素蘭，夏 爽，黃 麟，吳燕茹

（成都生物制品研究所，四川成都 610023）

因乙型腦炎活疫苗擴(kuò)大生產(chǎn)，對實驗動物的需求日益增大，我們新建了隔離器車間和207車間，并將204車間的SPF金黃地鼠全部轉(zhuǎn)移到隔離器車間，隔離器車間主要是保種育種，為207車間提供種子；207車間主要是SPF金黃地鼠飼養(yǎng)繁殖，為乙腦疫苗生產(chǎn)提供10～14日齡仔鼠。另外，204車間主要生產(chǎn)SPF小鼠和清潔級豚鼠，供各種產(chǎn)品動物試驗用；而205車間則是各種動物試驗的場所。

在動物從204車間轉(zhuǎn)移到隔離器車間的過程中，獨立通氣籠盒 （individually ventilated cages，IVC）是否能確保動物未受到污染?在動物從207車間供應(yīng)到乙腦生產(chǎn)車間以及從204車間供應(yīng)到205車間的過程中，各種動物運(yùn)輸盒又是否能確保動物未受到污染?帶著這樣的問題，我們開展了實驗動物運(yùn)輸盒微生物指標(biāo)驗證工作［1］。

運(yùn)輸盒是SPF動物（或清潔動物）在不同車間之間轉(zhuǎn)運(yùn)的籠具，運(yùn)輸盒應(yīng)具有一定的通透性，以保證其中的動物能正常呼吸，避免“出汗”或悶死；同時運(yùn)輸盒經(jīng)過有效的高壓滅菌后，在運(yùn)輸過程中應(yīng)保持良好的密閉性，微生物指標(biāo)應(yīng)達(dá)到預(yù)期的要求，防止外界臟空氣污染盒內(nèi)動物［2］。

本試驗選用了不同規(guī)格的籠盒來做檢測和比較，其中，小IVC籠盒主要用于金黃地鼠從204車間到隔離器車間的轉(zhuǎn)移；大IVC籠盒和普通運(yùn)輸盒主要用于小鼠、豚鼠從204車間到205車間的運(yùn)輸；以及金黃地鼠仔鼠從207車間到乙腦活疫苗生產(chǎn)車間的運(yùn)輸。

連續(xù)3次測試，結(jié)果顯示大、小IVC籠盒在整個實驗動物的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中微生物水平能始終保持在潔凈度C級標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)，為控制實驗動物運(yùn)輸盒質(zhì)量提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 運(yùn)輸盒

小IVC籠盒15個，規(guī)格（325×210×185）mm，蓋子頂部有一直徑60 mm的生命窗（帶濾膜），外觀完好，放入一個大的不銹鋼箱子中，箱子加蓋；大IVC籠盒3個，規(guī)格（500×360×280）mm，蓋子頂部有一直徑86 mm的生命窗（帶濾膜），外觀完好；甲普通運(yùn)輸盒3個，規(guī)格（466×314×200）mm，不銹鋼蓋子上有2張矩形濾膜，（229×111）mm，外觀完好；乙普通運(yùn)輸盒3個，規(guī)格（600×400×210）mm，塑料蓋子上有1張矩形濾膜，（402×203）mm，盒子兩側(cè)各有2張矩形濾膜，（188×66）mm，外觀完好；濾膜均為單層，材質(zhì)為無紡布，可清洗、耐高壓。

1.2 沉降皿

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA）平皿，直徑90 mm，由本所培養(yǎng)基室提供。

1.3 方法

TSA平皿和高壓滅菌后的運(yùn)輸盒按程序傳入204車間動物飼養(yǎng)間內(nèi)。在飼養(yǎng)間內(nèi)逐一打開運(yùn)輸盒，放入已標(biāo)記TSA平皿（小IVC籠盒1付/盒；大IVC籠盒2付/盒；普通運(yùn)輸盒2付/盒），打開平皿蓋，蓋好運(yùn)輸盒蓋子。將運(yùn)輸盒傳出飼養(yǎng)間，在204車間動物待發(fā)處放置0.5 h。小 IVC籠盒的轉(zhuǎn)移：按照《SPF金黃地鼠轉(zhuǎn)移方案》，將小 IVC籠盒從204車間經(jīng)車間外周道路運(yùn)送到207車間電梯口；經(jīng)電梯進(jìn)入二樓隔離器車間，通過走廊，經(jīng)清洗間傳遞窗進(jìn)入隔離器室；在隔離器室，逐一將小 IVC籠盒傳入隔離器內(nèi)，在隔離器內(nèi)打開籠盒，蓋上沉降皿蓋，取出沉降皿。大IVC籠盒和普通運(yùn)輸盒的轉(zhuǎn)移：將大IVC籠盒和普通運(yùn)輸盒從204車間經(jīng)車間外周道路運(yùn)送到205車間（中途繞行往返3次，相當(dāng)于到達(dá)病毒性疫苗一室的時間），在超凈工作臺上打開籠蓋，取出沉降皿。將培養(yǎng)皿送微生物實驗室培養(yǎng)，于（20～25）℃下倒置孵放3 d，計數(shù)菌落；再于（30～35）℃下倒置孵放2 d，計數(shù)菌落。培養(yǎng)皿沉降菌應(yīng)小于50 cfu/4h的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定［3］。

2 結(jié)果

2.1 采樣時間

平皿從放入籠盒打開蓋子，到從籠盒中取出，每次時間均在1 h以上，按1 h計算；

2.2 小IVC籠盒檢測結(jié)果

連續(xù)3次對小IVC籠盒進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。第1次試驗，各個籠盒都有不同程度長菌，1～6個/皿不等；第2、3次試驗效果較好，除一個平皿見10個菌落外，其余都為0～2個/皿；且每次檢測平均結(jié)果都小于50 cfu/4 h。

2.3 大IVC籠盒檢測結(jié)果

連續(xù)3次對大IVC籠盒進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。試驗中各個籠盒都有不同程度長菌，0～6個/皿不等；且每次檢測平均結(jié)果都小于50 cfu/4 h。

2.4 普通運(yùn)輸盒檢測結(jié)果

第1次為甲普通運(yùn)輸盒，培養(yǎng)結(jié)果可見較多霉菌，多數(shù)在10個/皿以上，雖然細(xì)菌菌落數(shù)不多，都在5個/皿以下，但各種菌落總數(shù)平均結(jié)果都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于50 cfu/4 h。第2次改為乙普通運(yùn)輸盒，檢測結(jié)果與第1次一致，說明普通運(yùn)輸盒隔離保護(hù)效果不理想，故不再做第3次試驗。詳見表3。

2.5 空白對照

每次試驗都附帶3個平皿作空白對照，培養(yǎng)結(jié)果均未見任何菌落，表明TSA培養(yǎng)基本身是沒有被污染的。詳見表4。

2.6 菌落形態(tài)

IVC籠盒試驗結(jié)果均為細(xì)菌菌落，其中90％細(xì)菌的菌落為乳白色，突起，濕潤，光滑，圓形，不透明，直徑1.5～3.0 mm；10％細(xì)菌為淺黃色，突起，濕潤，光滑，圓形，不透明，直徑0.5～1.5 mm。

普通運(yùn)輸盒試驗結(jié)果多見霉菌，其中80％霉菌為灰藍(lán)色，較小霉菌點，表面呈粉末狀；20％霉菌為大量絨毛狀菌絲，黃色粉末，充滿整個平皿。

表1 小IVC籠盒3次檢測結(jié)果Tab.1 Microbial test results of settling plates in small IVC cages

表2 大IVC籠盒3次檢測結(jié)果Tab.2 Microbial test results of settlingplates in large IVC cages

3 討論

在國內(nèi)，動物運(yùn)輸盒材料主要有紙質(zhì)和塑料兩種，運(yùn)輸盒上附帶的濾膜也多是單層多孔無仿布；膜面積越小，盒內(nèi)污染的機(jī)會越小。本試驗僅選擇了塑料運(yùn)輸盒，供大家參考。

表3 普通運(yùn)輸盒2次檢測結(jié)果Tab.3 Microbial test results of settling plates in conventional trasport cages

表4 空白對照3次檢測結(jié)果Tab.4 Microbial test results of settling plates in blank controls

甲普通運(yùn)輸盒帶不銹鋼蓋，蓋子上方矩形面積內(nèi)密布條形孔，夾一層濾膜；乙普通運(yùn)輸盒帶塑料蓋，蓋子上方和盒子兩側(cè)打孔，密布直徑2～3 mm圓孔，覆蓋一層濾膜。較大面積的濾膜讓其通透性倍增，微生物侵入的幾率也同時增加，以至沉降菌檢測結(jié)果大大超標(biāo)，而且有許多霉菌，不能達(dá)到潔凈度C級標(biāo)準(zhǔn)的微生物要求。

大小IVC籠盒蓋上蓋子后，只有生命窗通過濾膜與外界相通，密閉性很好，只有在開蓋裝動物時盒子內(nèi)部才全部暴露在飼養(yǎng)間環(huán)境中，所以沉降菌檢測結(jié)果較少，而且大都是細(xì)菌，菌落形態(tài)與飼養(yǎng)間環(huán)境內(nèi)的沉降菌基本一致，符合C級標(biāo)準(zhǔn)的微生物要求；所以，與普通運(yùn)輸盒相比較，IVC籠盒作為運(yùn)輸盒更理想。

試驗中小IVC籠盒又被裝入大不銹鋼箱中，所以沉降菌檢測結(jié)果比大IVC籠盒還少；因此可以證明SPF金黃地鼠在從204車間轉(zhuǎn)運(yùn)到隔離器車間時未受到污染。

試驗檢測結(jié)果中第1次普遍高于第2，3次，這可能與開蓋放平皿的熟練程度有關(guān)，第1次放入操作較慢，飼養(yǎng)間空氣落下菌要多些，后來動作快了，落下菌就少了。

另外，試驗中分離的細(xì)菌霉菌未進(jìn)一步鑒定。是否有SPF動物要求排除的細(xì)菌；是否與飼養(yǎng)間環(huán)境菌、與外界空氣中微生物的種類相一致，需要進(jìn)一步鑒定、比較和分析。