抗壞血酸對癲癇大鼠海馬分子伴侶介導的自噬激活的影響*

曹麗麗， 遲令懿， 張同霞， 王勝軍， 趙秀鶴， 劉學伍， 遲兆富

(山東大學齊魯醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2神經(jīng)外科，山東濟南250012)

分子伴侶介導的自噬(chaperone－mediated autophagy，CMA)是特定的胞漿蛋白結(jié)合到分子伴侶后轉(zhuǎn)運到溶酶體，然后被清除掉。胞質(zhì)中有30%的蛋白質(zhì)是通過CMA被溶酶體降解的。CMA的底物都是可溶的蛋白質(zhì)分子，首先被胞漿中的包含hsc70的分子伴侶復合物識別，然后再與溶酶體膜上受體的2a型溶酶體相關膜蛋白(lysosome－associated mem-brane protein type 2a，LAMP2a)相互作用后被轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中被消化掉。CMA活性主要靠LAMP2a的水平來進行調(diào)節(jié)，CMA的活性與LAMP2a的水平直接相關［1－2］。CMA在多數(shù)細胞內(nèi)都處于相當?shù)偷幕A水平，多種應激壓力可以激活CMA。饑餓可以最大限度地激活CMA。有研究證實氧化應激和毒性混合物暴露所誘導的應激也可激活CMA。氧化應激會上調(diào)LAMP2a受體轉(zhuǎn)錄水平，使其合成增加，從而提高CMA清除氧化損傷蛋白質(zhì)的能力［3］。

研究發(fā)現(xiàn)氧化應激自由基和脂質(zhì)過氧化與癲癇的發(fā)生、發(fā)展與治療有著十分密切的關系，無論動物實驗還是臨床觀察均表明癲癇時腦組織內(nèi)伴有非?；钴S的活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基活動。在癲癇反復發(fā)作時，ROS的生成和過氧化也許是造成細胞死亡的重要原因之一，通過保護自由基所造成的破壞就可以減少癲癇發(fā)作所致的細胞死亡。丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，反映了組織自由基的水平。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是機體內(nèi)重要的自由基清除劑，保護腦組織免受過氧化損傷?？箟难?ascorbic acid，AA)為是一種較強的抗氧化劑，研究證實AA可減輕癲癇海馬組織損傷，具有抗癲癇作用，推測可能與其降低低密度脂蛋白的過氧化和氧化應激反應有關［4－5］。然而AA的神經(jīng)保護作用的確切機制仍不清楚。

癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)的氧化應激損傷中是否存在CMA的激活現(xiàn)象，以及ROS對于CMA的激活是否是必需的，國內(nèi)外均罕見相關的報道。本文利用匹羅卡品(pilocarpine，Pilo)誘導的癲癇動物模型來評價CMA在癲癇海馬損傷中的作用，并從CMA的角度進一步探討了抗氧化劑AA的神經(jīng)保護作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 6～8周齡健康雄性Wistar大鼠，體重220～250 g，由山東大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 Pilo、丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺購自Sigma，兔抗大鼠LAMP2a多克隆抗體購于Santa Cruz，過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗由北京中杉金橋生物技術公司提供，AA由Sigma提供。MDA和SOD試劑盒由南京建成生物工程有限公司提供?；瘜W發(fā)光試劑盒購于北京中杉金橋生物技術公司。

2 方法

2.1 動物模型的建立和分組

2.1.1 動物模型的建立 健康雄性Wistar大鼠分籠飼養(yǎng)于恒溫(20±2)℃、恒濕(50%～60%)、無特殊病原體條件下，飲用水和標準飼料均經(jīng)滅菌后供動物自由食用。致癇步驟:首先皮下注射氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg，用以拮抗Pilo的外周膽堿能反應，30 min后腹腔注射Pilo 340 mg/kg，然后密切觀察大鼠的行為學變化，并按Racine標準判定癲癇發(fā)作的程度，達到3～5級的大鼠被認為Pilo模型制作成功，歸入實驗組。大鼠癲癇2 h后，腹腔注射地西泮4 mg/kg，以終止發(fā)作。對照組采用生理鹽水代替Pilo。AA預處理組為Pilo注射前30 min腹腔注射WM(500 mg/kg)。

2.1.2 實驗動物分組 60只大鼠隨機分為空白對照組(control)、癲癇發(fā)作后24 h組Pilo、AA(500 mg/kg)預處理癲癇組(AA+Pilo)和AA對照組(AA)，每組15只。各組動物分別在腹腔注射24 h后處死。

2.2 MDA和SOD檢測

2.2.1 腦組織勻漿的制備 實驗后將大鼠迅速斷頭取腦，在冰盤上分離海馬，稱重，制成腦組織勻漿。勻漿液離心(3 500 r/min，15 min)，取上清液測定SOD或MDA。

2.2.2 MDA的檢測 MDA是過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物之一，可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，其吸光度(A)與MDA含量呈正比。

2.2.3 SOD的檢測 超氧陰離子自由基與氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，在550 nm處有最大吸收峰，其A值與SOD活性呈反比。

2.3 蛋白質(zhì)的測定

2.3.1 海馬總蛋白的提取 各實驗組大鼠在相應時點快速斷頭處死，快速開顱分離出雙側(cè)海馬，冰冷生理鹽水沖洗;標本加入3倍體積的裂解緩沖液(210 mmol/L甘露醇，70 mmol/L蔗糖，10 mmol/L Tris－HCl，pH 7.5，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，5 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L 二硫蘇糖醇，1 mmol/L釩酸鈉)，冰浴中充分研磨，放置10 min;然后15 000×g、4℃離心10 min;加入蛋白上樣液，沸水煮5 min，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 Western blotting法檢測蛋白 樣本(40 μg)經(jīng)12%分離膠、5%濃縮膠SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳后，通過電轉(zhuǎn)膜儀(Bio－Rad)90 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)印蛋白至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的洗脫緩沖液室溫封閉1 h，加入抗LAMP2a(1∶200)的兔抗溶液，4℃孵育過夜;洗后加過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶3 000～1∶5 000)，37 ℃孵育1 h;洗后再移入顯色液中，曝光后顯影、定影，最后掃描并圖像分析。

2.4 RT－PCR法測定LAMP2a mRNA水平 將實驗大鼠斷頭處死，迅速取出大腦，在低溫修塊臺上快速分離出雙側(cè)海馬，放入焦碳酸二乙酯處理過的Eppendorf管內(nèi)，置于－80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。按照Trizol試劑盒操作說明提取海馬總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應成 cDNA后進行25 μL體系 PCR反應。LANP2a上游引物 5＇－ TACTACGACACTCACTCC －3＇，下游引物5＇－CATGTTGACATTCACTTC －3＇，擴增片段 298 bp。內(nèi)參照β－actin上游引物 5’－GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT－3’，下游引物5’－TGATCCACATCTGCTGGAAGGT－3’，擴增片段142 bp。PCR反應條件為:LAMP2a:94℃預變性 5 min，94 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30 個循環(huán)后，72℃10 min;β－actin:94℃預變性5 min，94℃ 40 s，52℃ 40 s，72℃ 10 min，30個循環(huán)后，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上觀察拍照，并運用AlphaEase FC分析軟件對條帶進行吸光度掃描，檢測各組LAMP2a mRNA擴增產(chǎn)物與其對應的內(nèi)參照β－actin mRNA擴增產(chǎn)物A值，然后將LAMP2a/β－actin的值進行統(tǒng)計學分析。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 癲癇大鼠海馬氧化應激水平的測定

癲癇大鼠海馬組織MDA明顯高于對照組，SOD明顯低于對照組;AA預處理癲癇組大鼠海馬組織MDA的含量顯著低于癲癇組，SOD的水平顯著高于癲癇組。AA對照組與正常對照組之間MDA和SOD的水平無顯著差異，見表1。

2 癲癇大鼠海馬分子伴侶介導的自噬的變化

結(jié)果顯示癲癇大鼠海馬組織LAMP2a mRNA和蛋白的水平均顯著高于對照組，AA預處理癲癇組海馬LAMP2a mRNA和蛋白的水平顯著低于癲癇組。AA對照組與正常對照組之間的LAMP2a mRNA和蛋白水平無顯著差異，見圖1。

表1AA對癲癇大鼠海馬組織MDA和SOD的影響Table 1.Effect of AA on MDA and SOD in rat hippocampus after seizures(±s.n=5)

表1AA對癲癇大鼠海馬組織MDA和SOD的影響Table 1.Effect of AA on MDA and SOD in rat hippocampus after seizures(±s.n=5)

Pilo:pilocarpine;AA:ascorbic acid.＊＊ P ＜ 0.01 vs control group;▲P ＜0.05 vs Pilo group.

Group MDA(μmol/g protein) SOD(U/mg protein)Control 2.05 ±0.48 219.46 ±63.48 AA 1.82 ±0.55 234.28 ±68.24 Pilo 4.99 ±1.14＊＊ 94.82 ±27.53＊＊AA+Pilo 3.15 ±0.65▲ 169.64 ±56.50▲

Figure 1.LAMP2a protein(A)and mRNA(B)levels in hippocampus of rats.Pilo:pilocarpine;AA:ascorbic acid.±s.n=5.##P＜0.01 vs control group;*P ＜0.05 vs Pilo group.圖1 癲癇大鼠海馬LAMP2a mRNA和蛋白的變化以及AA對LAMP2a的影響

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作腦組織抗氧化能力下降，脂質(zhì)過氧化和自由基損傷等氧化應激反應參與了癲癇的病理過程。另外，通過檢測LAMP2a的轉(zhuǎn)錄和合成水平，我們發(fā)現(xiàn)Pilo誘導的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬CMA激活，CMA的激活是通過LAMP2a的體內(nèi)合成增加來實現(xiàn)的。另外，抗氧化劑AA可部分地抑制激活的CMA。本研究證實癲癇發(fā)作可激活CMA，以及抗氧化劑AA降低氧化應激反應可抑制CMA的活性?？傊狙芯拷Y(jié)果提示氧化應激在SE的神經(jīng)病理過程中的作用至少部分與CMA有關。

自噬是胞漿大分子物質(zhì)和細胞器在膜包囊泡中大量降解的生物學過程。根據(jù)細胞物質(zhì)運到溶酶體內(nèi)的途徑不同自噬分為:(1)大自噬:即通常所說的自噬，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的單層膜凹陷形成杯狀雙層膜樣的分隔膜，進而完全包繞待降解物形成自噬體，接著與溶酶體融合，自噬體內(nèi)細胞物質(zhì)如細胞器被溶酶體酶溶解;(2)小自噬:是溶酶體的膜直接包裹如長壽命蛋白并在溶酶體內(nèi)降解;(3)分子伴侶介導的自噬(CMA):胞漿內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白分子，所以CMA降解途徑在清除蛋白質(zhì)時有選擇性，而前兩者無明顯選擇性［1－2，6］。在饑餓狀態(tài)下，大自噬首先被激活，這時大自噬是蛋白降解的主要方式，但大自噬很快就進行性衰退。巨自噬激活后數(shù)小時CMA的活性才明顯升高，但CMA的激活持續(xù)時間明顯延長，此時溶酶體蛋白降解主要是通過CMA來完成［7］。在應激的初始階段，大自噬激活為細胞持續(xù)合成必需的大分子提供必需的物質(zhì)(氨基酸、脂質(zhì)、縮水甘油和核苷酸)，并且清除細胞受損的結(jié)構(gòu)。然而，如果應激持續(xù)存在，僅僅依靠非選擇性的降解細胞漿成分是不夠的，也不再是細胞所想要的，因為非選擇性的清除降解可能也同時降解了細胞原有的一些必需物質(zhì)和細胞新合成的對抗氧化應激的蛋白、生物大分子等。在這種情況下，對底物進行適當?shù)倪x擇更有利于細胞的生存。而對于氧化蛋白而言，CMA具有選擇性清除作用。CMA所具有的選擇性清除某些蛋白而不影響其它蛋白和結(jié)構(gòu)式的特點使得CMA較其它非選擇性溶酶體途徑更合適［8］。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)大鼠致癇后大自噬激活［9］，本次研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作24 h LAMP2a mRNA和蛋白均明顯增高，CMA處于激活狀態(tài);我們認為在癲癇發(fā)作的氧化應激狀態(tài)下巨自噬和CMA同時被激活，可以更加有效地清除不需要的、損傷的或多余的細胞器或其它結(jié)構(gòu)比如氧化應激蛋白和損傷的線粒體，減輕癲癇發(fā)作的神經(jīng)損傷，具有保護作用。

自由基與癲癇發(fā)病中癇性活動的產(chǎn)生與神經(jīng)細胞死亡息息相關。癲痛發(fā)作后產(chǎn)生大量ROS作用于線粒體，產(chǎn)生細胞毒性作用，一方面加重癲癇發(fā)作，另一方面促進神經(jīng)元死亡。自由基可產(chǎn)生大量的過氧化脂質(zhì)(peroxidation，LPO)，LPO和其代謝產(chǎn)物具有潛在的神經(jīng)毒性。我們發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作24 h海馬MDA(LPO的產(chǎn)物)的含量明顯升高，與既往的報道一致［10－11］。升高的MDA參與了癲癇的神經(jīng)損傷。腦組織存在多種的抗氧化機制，其中自由基清除劑SOD是主要的抗氧化系統(tǒng)，尤其在神經(jīng)元抗氧化應激反應中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)線粒體MnSOD表達下調(diào)的轉(zhuǎn)基因動物SOD2－/+小鼠在10～18月出現(xiàn)自發(fā)性癲痛發(fā)作［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作24 h海馬SOD的水平顯著下降。一方面自由基和脂質(zhì)過氧化抑制SOD的活性，另一方面SOD下降，細胞清除自由基的能力下降，對神經(jīng)元的保護作用減弱，形成惡性循環(huán)，進一步加重腦損傷。

CMA是在多種不同的細胞類型和組織中普遍存在的一種類型的自噬。細胞漿內(nèi)可溶性的蛋白，特別是氧化蛋白，主要是通過 CMA來降解。Kiffin等［3］發(fā)現(xiàn)就 CMA而言，CMA底物輕度的氧化應激不僅可以促進底物的溶酶體降解過程，而且促進底物和溶酶體膜的結(jié)合以及加速底物通過溶酶體膜的轉(zhuǎn)運過程。我們推測癲癇發(fā)作腦組織內(nèi)存在顯著的過氧化反應，產(chǎn)生大量的氧化損傷蛋白，CMA的激活可以加快異常蛋白的清除，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

維生素C(抗壞血酸)和維生素E是外源性的強抗氧化劑，與組織細胞內(nèi)內(nèi)源性抗氧化劑相互協(xié)同共同清除 ROS。抗壞血酸通過葡萄糖轉(zhuǎn)運體進入線粒體，在許多水平發(fā)揮抗氧化作用，它可以直接代謝ROS，維持維生素E的還原狀態(tài)，介導過氧化物酶的電子傳遞過程。我們既往的實驗已經(jīng)證實了維生素E對癲癇動物海馬的神經(jīng)保護作用。本次研究發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸預處理可顯著降低癲癇大鼠海馬MDA的水平，抑制脂質(zhì)過氧化反應，并且抗壞血酸通過提高SOD的水平增加海馬神經(jīng)元的抗氧化能力。通過減輕氧化應激反應，抗壞血酸可減輕成年癲癇大鼠的腦損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用［4－5］。

氧化應激是非饑餓誘導的CMA激活的重要機制，并且研究表明ROS是自噬激活所必需的［13－14］。本文進一步研究了抗氧化劑抗壞血酸是否可減輕CMA的活性。抗壞血酸預處理可減少LAMP2a的水平從而部分抑制CMA的活性，這一點與氧化應激在上游啟動或者調(diào)解CMA的觀點一致。需要注意的兩點是，首先抗壞血酸僅僅是部分地抑制CMA;其次，抗壞血酸并非直接抑制自噬，可能是通過清除CMA的激活調(diào)節(jié)物質(zhì)ROS后來實現(xiàn)。因為抗壞血酸具有多種生物學功能，抗壞血酸是膠原、單胺、氨基酸、肽激素和肉堿合成過程中輔酶的輔助因子，因此關于抗壞血酸抑制癲癇大鼠海馬CMA的激活以及神經(jīng)保護作用的確切機制需要進一步研究。

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