番石榴葉總?cè)茖?型糖尿病大鼠的降血糖和血脂作用*

王婧茹， 趙晶晶， 葉春玲△， 葉開和， 張曉琦， 王 英， 葉文才

(1暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，3暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所，暨南大學(xué)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究廣東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632;2廣東省婦幼保健院藥學(xué)部，廣東廣州510010)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種嚴(yán)重危害人類健康的內(nèi)分泌代謝疾病，其并發(fā)癥已成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后人類第三大致死原因［1］。番石榴(Psidium guajava L.)為桃金娘科番石榴屬植物，廣泛分布于我國嶺南地區(qū)。上世紀(jì)80年代，我國在進(jìn)行植物藥普查中發(fā)現(xiàn)，民間用番石榴葉來防治糖尿病;以番石榴葉粗提取物為原料的制劑“消渴降糖膠囊”的臨床療效顯著，但其降血糖的活性成分和作用機(jī)制尚不清［2］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)番石榴葉總?cè)?total triterpenoids from Psidium guajava leaves，TTPGL)能顯著降低1型糖尿病小鼠的血糖水平，因而推測TTPGL可能是番石榴葉降血糖的有效部位。為進(jìn)一步研究TTPGL的抗糖尿病作用，本實(shí)驗(yàn)建立了2型糖尿病(type 2 DM，T2DM)動物模型，觀察其對糖尿病大鼠血糖和血脂的影響并探討其作用機(jī)理。

材料和方法

1 材料

1.1 動物與飼料 4周齡清潔級健康SD大鼠90只，雄性，體重150～180 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2008－0002。高脂飼料:豬油18%，蔗糖20%，蛋黃3%，基礎(chǔ)飼料59%，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 試劑與藥品 番石榴葉總?cè)仆ㄟ^溶劑法純化工藝提取，收率為3.3%。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，購自Sigma;鹽酸羅格列酮片，購自上海三維制藥有限公司;胰島素放免試劑盒，購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。葡萄糖測試盒、游離脂肪酸測試盒、糖化血紅蛋白測試盒、糖化血清蛋白測試盒，均購自南京建成生物工程研究所。甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒，購自溫州東甌津瑪生物科技有限公司。兔抗過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator－ activated receptor γ，PPARγ)(H －100)(sc－7196，Santa Cruz);辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗和兔抗大鼠β－actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;SDSPAGE凝膠配制試劑盒和ECL顯影試劑盒購自碧云天生物科技研究所。

1.3 儀器 OneTouch強(qiáng)生穩(wěn)步血糖儀購自強(qiáng)生(中國)醫(yī)療器材有限公司，配套試紙批號為2990326011;Model 680酶標(biāo)儀購自Bio－Rad;低溫離心機(jī)購自Sigma;LAC－110.4型電子分析天平購自賽多利斯公司;SN－682B全自動γ計數(shù)器購自上海日環(huán)儀器有限公司;WO－9413B型凝膠成像系統(tǒng)購自北京六一儀器廠;POWER BC數(shù)控電泳儀購自上海申能博彩生物科技有限公司。

2 方法

2.1 2型糖尿病動物模型的建立及分組 雄性SD大鼠90只，分為正常對照組動物(control)12只和糖尿病建模動物78只，正常組動物給予基礎(chǔ)飼料，建模動物給予高脂飼料。喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，建模組腹腔注射2%STZ溶液(35 mg·kg－1)，1周后測定大鼠葡萄糖負(fù)荷2 h血糖(禁食12 h，給予2 g·kg－1的葡萄糖灌胃，測2 h后的血糖)，篩選血糖值大于11.1 mmol·L－1的大鼠確定為糖尿病大鼠。

模型穩(wěn)定1周后，將成模的糖尿病大鼠60只隨機(jī)分為5組，即番石榴葉總?cè)聘邉┝拷M(TTPGLH，240 mg·kg－1)、中劑量組(TTPGL － M，120 mg·kg－1)、低劑量組(TTPGL － L，60 mg·kg－1)，羅格列酮組(rosiglitazone，RSG，3 mg·kg－1)，糖尿病模型組(model)，每組各12只。

2.2 給藥方法 給藥組每天給予不同劑量的番石榴葉總?cè)苹蛄_格列酮灌胃，模型組和正常對照組則給予同體積的生理鹽水灌胃。每天給藥1次，連續(xù)給藥6周。每周末稱量體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。

2.3 觀測指標(biāo)及方法 采用強(qiáng)生公司OneTouch穩(wěn)步型血糖儀監(jiān)測實(shí)驗(yàn)期間大鼠靜脈全血血糖值。給藥6周結(jié)束后取大鼠血清，采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG);放射免疫測定法測定大鼠空腹血清胰島素含量(fasting insulin，F(xiàn)INS)，并計算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI=ln［FBG × FINS－1］);果糖胺法測定大鼠糖化血清蛋白(glycosylated serunm proteins，GSP)含量;酶聯(lián)免疫法測定大鼠血清甘油三酯(triglyceride，TG)和總膽固醇(total cholesterol，TCH)含量;酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血清游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)含量。取紅細(xì)胞制備溶血液，測定糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，GHb)含量。取大鼠腎周部位脂肪組織，生理鹽水沖洗后置－70℃冰箱保存，備測PPARγ蛋白的表達(dá)。

2.4 Western blotting檢測脂肪組織PPARγ蛋白表達(dá) 將脂肪組織于冰浴中勻漿后，經(jīng)4℃、12 000 r·min－1高速離心30 min提取蛋白。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。將提取的組織蛋白變性處理后，每孔50 μg蛋白上樣，其中1個上樣孔加入10 μL預(yù)染蛋白 marker，進(jìn)行電泳(5%濃縮膠90 V，10%分離膠110 V，不恒定電流)，約1.5 h，完畢后取分離膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉室溫封閉30 min ，4 ℃過夜，加入兔抗 PPARγ(1∶200)，37 ℃反應(yīng)1 h或4℃過夜，用PBS洗膜，第1次15 min，后3次每次5 min。加5 mL羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，37℃反應(yīng)1 h，洗膜同上。用ECL顯色試劑顯示目的條帶，采用WO－9413B型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件Gelpro32來分析膠片中的蛋白條帶。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 一般狀態(tài)

整個實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠飲食、飲水及活動等行為正常。高糖高脂飲食+腹腔注射小劑量STZ后約10 d，糖尿病大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦等癥狀，并出現(xiàn)毛色暗啞，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，動作遲緩的狀況。實(shí)驗(yàn)期間，模型組糖尿病大鼠以上狀態(tài)并未改善;而各給藥組糖尿病大鼠上述癥狀則明顯緩解，一般狀況有所改善。

實(shí)驗(yàn)期間正常組大鼠體重逐漸增加，而糖尿病大鼠體重明顯降低，顯著低于正常組(P＜0.01)，尤以第2周體重下降明顯;但從第3周開始，糖尿病大鼠體重逐漸增加。第6周時，羅格列酮組、番石榴葉總?cè)频蛣┝拷M大鼠體重有所增加，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.Changes of the weight of rats during the experiment.±s.n=9.＊＊ P ＜0.01 vs model.圖1 實(shí)驗(yàn)期間大鼠每周體重變化

2 糖尿病模型組動物實(shí)驗(yàn)期間血糖變化

模型成功后，在給藥的6周內(nèi)，每周監(jiān)測糖尿病模型組與正常組大鼠的空腹血糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個實(shí)驗(yàn)期間，正常組動物空腹血糖穩(wěn)定在正常水平，低于7.0 mmol·L－1;模型組糖尿病大鼠血糖顯著高于正常組(P＜0.01)，且一直維持在高于15.0 mmol·L－1的高血糖狀態(tài)，見圖2。

Figure 2.Changes of FBG in rats during the experiment.±s.n=9.＊＊P ＜0.01 vs control.圖2 實(shí)驗(yàn)期間大鼠每周FBG變化

3 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫驠BG、FINS和ISI變化的影響

與正常對照組相比，模型組的FBG顯著升高，F(xiàn)INS和ISI明顯降低，2組間有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)。與模型組相比，番石榴葉總?cè)浦袆┝?、高劑量組及羅格列酮組可顯著降低糖尿病大鼠的 FBG，升高 FINS和 ISI(P ＜0.05或 P ＜0.01)，見表1。

表1 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫驠BG、FINS和ISI變化的影響Table 1.Effects of TTPGL on FBG，F(xiàn)INS and ISI in T2DM rats(±s.n=9)

表1 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫驠BG、FINS和ISI變化的影響Table 1.Effects of TTPGL on FBG，F(xiàn)INS and ISI in T2DM rats(±s.n=9)

*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜ 0.01 vs model.

Control － 6.65±0.74 16.61±6.00 －4.63±0.27 Model － 17.20±6.02＊＊ 9.98±1.72* －5.24±0.20＊＊TTPGL 60 12.92±5.30＊＊ 14.39±5.17 －4.94±0.43 120 11.20±3.43＊＊##15.97±3.18## －4.90±0.24#240 9.59±2.46＊＊##18.02±4.09## －4.87±0.25#RSG 3 9.22±4.10*##15.05±6.56# －4.66±0.44#

4 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫驡Hb和GSP變化的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠GHb和GSP顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比，番石榴葉總?cè)平o藥組糖尿病大鼠血清GSP明顯降低(P＜0.01)，但GHb含量僅有輕度下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);羅格列酮組 GHb和 GSP含量均顯著降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見表2。

表2 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫驡Hb和GSP變化的影響Table 2.Effects of TTPGL on GHb and GSP in T2DM rats(±s.n=9)

表2 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫驡Hb和GSP變化的影響Table 2.Effects of TTPGL on GHb and GSP in T2DM rats(±s.n=9)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.

Group Dosage(mg·kg－1)GHb(Absorbance·10 g－1)GSP(mmol·L －1)Control － 15.24 ±3.82 1.12 ±0.12 Model － 20.79 ±4.48＊＊ 1.80 ±0.11＊＊TTPGL 60 19.55 ±2.38＊＊ 1.50 ±0.07＊＊##120 19.76 ±3.04＊＊ 1.42 ±0.05*##240 18.16 ±3.89* 1.37 ±0.07*##RSG 3 15.30 ±3.25# 1.32 ±0.06##

5 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫骉G、TCH和FFA變化的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清TG、TCH及FFA均顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比，番石榴葉總?cè)平o藥組、羅格列酮組血清TG、TCH及FFA 均顯著降低(P ＜0.05或 P ＜0.01)，見表3。

6 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫笾窘M織PPARγ蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠PPARγ蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.01)。給藥后，番石榴葉總?cè)苹蛄_格列酮可顯著升高糖尿病大鼠脂肪組織的PPARγ蛋白表達(dá)，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖3、表4。

表3 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫骉G、TCH和FFA變化的影響Table 3.Effects of TTPGL on TG，TCH and FFA in T2DM rats(±s.n=9)

表3 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫骉G、TCH和FFA變化的影響Table 3.Effects of TTPGL on TG，TCH and FFA in T2DM rats(±s.n=9)

*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.

Control － 1.00±0.20 1.03±0.16 183.1±36.6 Model － 2.22±0.74＊＊ 1.46±0.11＊＊ 360.3±49.0＊＊TTPGL 60 1.23±0.33*##1.27±0.15*# 197.8±30.8##120 1.11±0.19## 1.22±0.24*# 189.6±26.6##240 1.10±0.29## 1.21±0.19*# 189.6±31.5##RSG 3 1.19±0.49*##1.22±0.17*# 197.8±67.5##

Figure 3.Effects of TTPGL on PPARγ expression in adipose tissues of T2DM rats.圖3 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫笾窘M織PPARγ蛋白表達(dá)的影響

表4 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫笾窘M織PPARγ蛋白表達(dá)的影響Table 4.Effects of TTPGL on PPARγ expression in adipose tissues of T2DM rats(±s.n=3)

表4 番石榴葉總?cè)茖μ悄虿〈笫笾窘M織PPARγ蛋白表達(dá)的影響Table 4.Effects of TTPGL on PPARγ expression in adipose tissues of T2DM rats(±s.n=3)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs model.

Group Dosage(mg·kg－1) PPARγ/β －actin Control － 0.2954 ±0.0890 Model － 0.1723 ±0.0420*TTPGL 60 0.2011 ±0.0500*120 0.2432 ±0.0610#240 0.2302 ±0.0570#RSG 3 0.2557 ±0.0630#

討 論

采用高糖高脂飼料加小劑量STZ方法建立2型糖尿病模型是目前最常采用的方法［3－4］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖高脂喂養(yǎng)4周，腹腔注射小劑量STZ(35 mg·kg－1)后，糖尿病大鼠成模率高(85%)，死亡率低(6%)，并且在給藥的6周過程中模型組大鼠血糖穩(wěn)定在15 mmol·L－1左右，只有1例大鼠出現(xiàn)血糖自行恢復(fù)的現(xiàn)象。因此可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)成功建立了2型糖尿病模型。

GHb是血紅蛋白與糖類經(jīng)非酶促結(jié)合而生成的。它的合成過程緩慢且相對不可逆，貫穿于紅細(xì)胞整個生命期當(dāng)中(120 d)，其合成速率與紅細(xì)胞所處環(huán)境中的糖濃度成正比，因此，GHb所占比率能反映測定點(diǎn)之前1～2個月甚至更長時間內(nèi)的平均血糖水平，它可以作為觀察糖尿病血糖控制水平及抗糖尿病藥物效應(yīng)的指標(biāo)［5］。GSP是一類類似果糖胺的物質(zhì)，是血漿中蛋白質(zhì)與葡萄糖非酶糖化過程中形成的一種高分子酮胺結(jié)構(gòu)，其濃度與血糖水平呈正相關(guān)，并保持相對穩(wěn)定。由于血漿白蛋白的半衰期為17～20 d，故GSP反映的是測定前1～3周內(nèi)血糖的平均水平［6］。GHb不僅是糖尿病有效血糖控制的“金指標(biāo)”，而且對于心血管疾病、糖尿病腎病、白內(nèi)障等疾病的預(yù)防和治療有非常重要的意義。GSP從一定程度上彌補(bǔ)了GHb不能反映較短時期內(nèi)血糖濃度變化的不足，是鑒別應(yīng)激性血糖升高和糖尿病的有效指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，番石榴葉總?cè)浦委熃M動物在給藥6周后的GHb雖呈下降趨勢，但并無統(tǒng)計學(xué)意義。而從GSP的結(jié)果看，番石榴葉總?cè)平o藥組動物與模型組相比均顯著下降。此結(jié)果提示番石榴葉總?cè)瓶赡苄枰o藥3～4周后才能發(fā)揮顯著降血糖效果。

胰島素具有促進(jìn)脂蛋白分解的作用，當(dāng)胰島素分泌不足或體內(nèi)產(chǎn)生胰島素抵抗時，機(jī)體血液中的甘油三酯、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白明顯升高，引起脂質(zhì)代謝異常［7－8］。高血糖加高血脂可明顯加速糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及其進(jìn)展［9］。因此，糾正2型糖尿病的脂代謝紊亂，對于減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，番石榴葉總?cè)瓶娠@著降低糖尿病大鼠血清甘油三酯、總膽固醇及游離脂肪酸水平，提示番石榴葉總?cè)颇苊黠@改善脂代謝紊亂，可能對改善胰島素抵抗及防治糖尿病伴發(fā)的高脂血癥具有重要意義。

胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，改善胰島素抵抗是治療2型糖尿病的重要策略。PPARγ是PPAR核受體超家族成員之一，可在骨骼肌、肝細(xì)胞和脂肪組織中表達(dá)，是調(diào)節(jié)脂肪、葡萄糖的配體活化型核受體。噻唑烷二酮類(thiazolidinediones，TZDs)藥物是目前臨床主要的改善胰島素抵抗、增加胰島素敏感性的藥物，它是一類高選擇性PPARγ的激動藥，進(jìn)入靶細(xì)胞后激活PPARγ核受體，調(diào)節(jié)胰島素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控多種影響糖、脂代謝基因的轉(zhuǎn)錄，使胰島素作用放大，增強(qiáng)胰島素在外周組織的敏感性，減輕胰島素抵抗，控制血糖水平［10－11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TZDs藥物羅格列酮能顯著對抗糖尿病大鼠血糖、血脂的升高，升高胰島素敏感指數(shù)以及脂肪組織PPARγ蛋白表達(dá)水平，此結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致［12］。同樣，給予番石榴葉總?cè)浦委熀?，糖尿病大鼠空腹血糖與模型組相比明顯降低，而胰島素含量明顯回升，胰島素敏感指數(shù)顯著提高，并且呈現(xiàn)一定程度的劑量相關(guān)性。同時，脂肪組織PPARγ蛋白表達(dá)顯著增加。上述結(jié)果提示番石榴葉總?cè)频目固悄虿∽饔脵C(jī)理可能與其提高脂肪組織PPARγ的表達(dá)，增加靶組織對胰島素的敏感性有關(guān)。

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