芪藶強心對心肌梗死后大鼠心肌細胞凋亡的影響

肖 駿， 馬 渝， 鄧松柏， 佘 強， 黃開順

(1重慶市急救醫(yī)療中心心內(nèi)科，重慶400014;2重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，重慶400010;3重慶醫(yī)科大學基礎研究所，重慶400016)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)后心肌細胞凋亡是觸發(fā)心室重構(gòu)導致心力衰竭的重要原因［1－2］，阻止梗死后心肌細胞凋亡可以減少心室重構(gòu)，改善心功能［3］。既往實驗表明，心肌梗死后心肌組織中黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)高度表達和活性增加，通過催化活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的大量生成，導致心肌肥厚和室腔擴張［4－5］。業(yè)已證實，中成藥芪藶強心膠囊通過改善血管內(nèi)皮功能［6］，免疫調(diào)節(jié)等［7］機制改善心功能，其有效成分如人參、黃芪和丹參能夠抑制XO的活性［8］及氧化應激［9－10］，但對心肌梗死后心肌細胞凋亡的影響目前尚未見報道。本研究擬觀察芪藶強心對大鼠心肌梗死模型心肌細胞凋亡的影響并探討其可能的相關(guān)機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 雄性SD大鼠55只(由第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院實驗動物中心提供)，體重180～230 g。

1.2 藥物與主要試劑 芪藶強心膠囊生粉(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司);抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測試盒、羥自由基測試盒和黃嘌呤氧化酶測試盒(南京建成生物工程研究所);兔抗鼠多克隆抗體:黃嘌呤氧化酶(Santa Cruz)、Fas(Santa Cruz)、caspase－3(NeoMarkers)和β－actin(武漢博士德生物工程有限公司);即用型SABC試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(北京中杉生物技術(shù)有限公司);Prestained Protein Ladder(Fermentas);DNA Marker DL2000(TaKaRa);其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 GE Vivid 7彩色多普勒超聲診斷儀(通用電氣公司);Olympus IX－70顯微鏡(奧林巴斯株式會社);電泳儀、轉(zhuǎn)印儀、垂直電泳槽、凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio－Rad);752型紫外分光光度儀(上海青華科技儀器公司)。

2 方法

2.1 動物模型制備及分組 參照文獻介紹的方法［7］，取50只大鼠于肺動脈圓錐與左心耳之間距主動脈根部3 mm處用無創(chuàng)縫合線(7－0)結(jié)扎冠脈前降支制作MI模型，術(shù)后共存活31只，隨機分為心肌梗死組(MI，蒸餾水2 mL·d－1灌胃)16只，芪藶強心組(Qiliqiangxin，4 g·kg－1·d－1灌胃)15 只;另設假手術(shù)組(sham)5只，僅在前降支上留一松結(jié)，不結(jié)扎。術(shù)后24 h開始藥物干預，連續(xù)28 d。

2.2 超聲心動圖檢測 腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉(30 mg·kg－1)全麻大鼠，仰臥位固定后胸部備皮，用GE Vivid 7彩色多普勒超聲診斷儀進行心臟超聲檢測，探頭頻率為13 MHz，深度3.5 cm，速度200 mm·s－1。在取得滿意的胸骨旁左心室短軸二維圖像后，于乳頭肌水平將M型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得M型超聲心動圖，測定左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end－diastolic dimension，LVEDD)、短軸縮短分數(shù)(factional shortening，F(xiàn)S)和射血分數(shù)(ejection faction，EF)，取連續(xù)3個心動周期的平均值。超聲檢查的操作及分析均由不知道大鼠分組情況的?？漆t(yī)生完成。

2.3 心肌梗死面積的測定 沿梗死區(qū)中部垂直于左心室長軸的方向制作石蠟組織切片(5 μm厚)，HE染色后用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件測定左心室心外、內(nèi)膜周長和梗死區(qū)心外、內(nèi)膜長度，取平均值后按以下公式計算:梗死面積(infarction size，IS)=(梗死區(qū)心外膜長度+梗死區(qū)心內(nèi)膜長度)/(左心室心外膜周長+左心室心內(nèi)膜周長)。剩余心肌組織經(jīng)液氮速凍后存于－80℃冰箱。

2.5 心肌細胞凋亡原位檢測 采用TUNEL法檢測，按說明書操作。光鏡下(10×20倍)觀察，陽性細胞核為棕黃色，隨機選擇5個無重疊視野，分別記數(shù)凋亡心肌細胞數(shù)和心肌細胞總數(shù)，二者百分比作為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

2.6 DNA凝膠電泳(DNA ladder) 酚/氯仿法抽提各組細胞總DNA，取10 μL DNA于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.4 mg/L溴化乙啶)中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并成像。

2.7 心肌組織Fas蛋白表達檢測 采用鏈霉親和素－生物素－過氧化酶復合物法進行免疫組化檢測，按說明書操作。以PBS代替Ⅰ抗體作為陰性對照。光鏡下(10×20倍)觀察，陽性細胞為棕黃色，隨機選擇5個無重疊視野，用Image－Pro Plus 4.5軟件測定陽性表達區(qū)積分吸光度值(integrated absorbance value，IA)作為半定量參數(shù)，用以反映Fas蛋白陽性表達程度。

2.8 Western blotting檢測XO和caspase－3蛋白表達 取100 mg凍存心肌組織用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。取40 μg蛋白量經(jīng)SDS－PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后分別與XO和caspase－3抗體(1∶400)4℃孵育過夜，β－actin(1∶200)作為內(nèi)標，加辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(1∶1 500)37℃孵育2 h，DAB顯色，以凝膠成像系統(tǒng)掃描后用Quantity One 4.4.0圖像分析軟件進行半定量灰度分析，分別計算XO、caspase－3與βactin吸光度值比值代表其相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 超聲心動圖結(jié)果和心肌梗死面積

28 d后大鼠MI組死亡6只，芪藶強心組死亡1只，sham組全部存活。與 sham組比較，MI組LVEDD增大，F(xiàn)S和EF降低(P＜0.01);芪藶強心組與MI組比較，LVEDD明顯減小，F(xiàn)S和EF明顯升高(P＜0.01)，其梗死面積雖有所降低，但兩組間無顯著差異(P ＞0.05)，見圖1、2 和表1。

Figure 2.Representative left ventricle cross－section with HE staining 28 days after myocardial infarction(MI).A:sham group;B:MI group;C:Qiliqiangxin group.Arrows indicate myocardial infarcted zones.圖2 大鼠心肌梗死后28 d左心室橫切面切片

表1 芪藶強心對心室重構(gòu)的影響Table 1.Effect of Qiliqiangxin on ventricular remodeling(±s)

表1 芪藶強心對心室重構(gòu)的影響Table 1.Effect of Qiliqiangxin on ventricular remodeling(±s)

＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group

Group n LVEDD(mm) FS(%) EF(%) IS(%)Sham 5 5.8 ±0.9 53.94 ±8.41 74.86 ±5.66 －MI 10 7.2 ±0.8＊＊ 31.97 ±5.88＊＊ 35.47 ±2.25＊＊ 30.6 ±3.2 Qiliqiangxin 14 6.2 ±0.5## 46.50 ±7.82## 56.38 ±5.45＊＊##28.4 ±2.9

2 心肌細胞凋亡指數(shù)

TUNEL染色結(jié)果顯示，凋亡心肌細胞核呈棕黃色，主要分布在非梗死區(qū)。MI組與sham組比較，AI顯著升高(P＜0.01);芪藶強心組AI與MI組比較明顯下降(P＜0.01)，見圖3。

3 心肌組織DNA凝膠電泳結(jié)果

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，sham組心肌細胞DNA呈現(xiàn)1條光亮的條帶，緊靠加樣孔，為正常心肌細胞DNA帶型;MI組DNA片段分布較彌散，可見典型的梯狀帶紋(DNA ladder);芪藶強心組DNA片段彌散程度較輕，DNA ladder消失，見圖4。

4 心肌組織Fas蛋白表達

免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)as蛋白陽性表達呈棕黃色顆粒，定位于胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)。與sham組比較，MI組Fas蛋白IA明顯升高(P＜0.01);芪藶強心組與MI組比較，F(xiàn)as蛋白 IA值顯著降低(P＜0.01)，見圖5。

5 心肌組織caspase－3蛋白表達

Western blotting結(jié)果顯示，與sham組比較，MI組心肌組織caspase－3蛋白表達顯著增強(P＜0.01);芪藶強心組與MI組比較，caspase－3蛋白表達明顯降低(P＜0.01)，見圖6。

Figure 3.Apoptotic myocardial cells in non－infarcted zones detected by TUNEL staining(×200).A:sham group;B:MI group;C:Qiliqiangxin group.±s.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group.圖3 TUNEL染色檢測大鼠心肌梗死后左心室非梗死區(qū)心肌細胞凋亡

Figure 4.Agarose gel electrophoresis of myocardial DNA in non－ infarcted zones.M:DNA marker;1:sham group;2:MI group;3:Qiliqiangxin group.圖4 大鼠心肌梗死后左心室非梗死區(qū)心肌組織DNA凝膠電泳

Figure 5.Expression of Fas protein in non－infarcted zones detected by immunohistochemistry staining(×200).A:sham group;B:MI group;C:Qiliqiangxin group.±s.＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group.圖5 大鼠心肌梗死后左心室非梗死區(qū)心肌Fas蛋白的表達

Figure 6.Expression of xanthine oxidase(XO)and caspase－3 in non－infarcted zones detected by Western blotting.±s.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.圖6 大鼠心肌梗死后左心室非梗死區(qū)XO和caspase－3蛋白的表達

6 心肌組織黃嘌呤氧化酶活性及蛋白表達

與sham組比較，MI組心肌組織XO活性明顯升高，Western blotting結(jié)果顯示XO蛋白表達增強(P＜0.01);芪藶強心組與MI組比較，XO活性明顯降低(P＜0.01)，而XO蛋白表達兩組間無顯著差異(P＞0.05)，見圖 6、表2。

表2 芪藶強心對氧化應激的影響Table 2.Effect of Qiliqiangxin on oxidative stress(±s)

表2 芪藶強心對氧化應激的影響Table 2.Effect of Qiliqiangxin on oxidative stress(±s)

＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group.

Group n Activity of XO(103U·g－1protein)Activity of scavenging(U·g－1protein)Activity of OH·scavenging(103U·g－1protein)Sham 5 0.21 ±0.05 151.38 ±9.57 253.03 ±17.39 MI 10 1.62 ±0.19＊＊ 64.77 ±8.50＊＊ 91.67 ±16.21＊＊Qiliqiangxin 14 0.43 ±0.13## 97.72 ±8.99＊＊## 177.02 ±9.56＊＊##

7 心肌組織清除和OH·活性

討 論

芪藶強心膠囊是新近研發(fā)出治療心力衰竭的中成藥，其有效成分包括人參、黃芪、丹參、附子等傳統(tǒng)中藥材。動物實驗表明芪藶強心通過免疫調(diào)節(jié)改善心肌梗死后功能紊亂［7］;臨床實驗也證實其治療輕、中度充血性心力衰竭安全有效［6］。本研究中芪藶強心組超聲心動圖示LVEDD明顯減小，EF和FS明顯升高也證實了這一點;但芪藶強心改善心臟重塑是否與抑制心肌細胞凋亡有關(guān)，目前少見報道。

心肌梗死后，梗死區(qū)心肌細胞急速、大量的缺失系壞死所致，而隨后的心肌細胞數(shù)量減少則與凋亡有關(guān)，心肌細胞凋亡是梗死范圍擴大的一個獨立因子，導致局部室壁變薄和室腔擴大，即發(fā)生早期重塑;非梗死區(qū)心肌細胞凋亡則是引起晚期左心室重塑和心功能不全的重要因素［11］。本研究用TUNEL方法證實，在心肌梗死后28 d，MI組非梗死區(qū)心肌細胞凋亡指數(shù)明顯高于sham組，凋亡細胞主要分布在梗死區(qū)周圍的心肌，與前述報道相一致。這可能與該區(qū)域存活的心肌細胞因缺血程度較輕但仍受到氧自由基的持續(xù)作用有關(guān)，而缺血中心因嚴重的缺血缺氧而發(fā)生細胞壞死。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，MI組出現(xiàn)典型的DNA ladder圖譜，也支持TUNEL檢測結(jié)果。芪藶強心組非梗死區(qū)心肌細胞凋亡指數(shù)與MI組比較顯著降低，DNA降解程度減輕，梯狀帶紋消失，表明芪藶強心可以抑制心肌梗死后非梗死區(qū)心肌細胞凋亡。但在本研究時限內(nèi)，芪藶強心組與MI組比較，其梗死面積雖有所降低，但兩組間差異無顯著(P＞0.05)，這可能與本研究時限和例數(shù)有關(guān)。

凋亡是由基因控制的程序性細胞死亡，許多基因和蛋白參與細胞凋亡過程。fas基因是一種重要的凋亡促進基因，易受氧化應激激活而促進細胞凋亡。Fas/FasL系統(tǒng)是體內(nèi)直接啟動細胞凋亡的死亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，其通過與Fas相關(guān)死亡區(qū)(Fas－associated death domain，F(xiàn)ADD)蛋白的結(jié)合，激活FADD的死亡效應區(qū)，并使其與caspase－8結(jié)合，caspase－8再激活其下游的 caspase－3，導致細胞凋亡［12］。Zhu等［2］報道，F(xiàn)as蛋白表達程度與細胞凋亡增加的時相一致，表明fas基因的表達改變與缺血心肌細胞凋亡的關(guān)系密切。而通過抗氧化作用減少Fas蛋白的表達，可以減少心肌梗死后晚期再灌注的心肌細胞凋亡。研究證實［13］，caspase－3是 Fas介導細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應中處于中心地位的執(zhí)行者，是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶，被激活后可通過激活脫氧核糖核酸酶(caspase－activated deoxyribonuclease，CAD)引起DNA降解、細胞凋亡，抑制caspase－3酶活性或拮抗caspase－3功能可使細胞凋亡受抑。Sam等［11］發(fā)現(xiàn)心肌梗死后非梗死區(qū)心肌細胞凋亡增加，伴有caspase－3活性增高。本研究用免疫組化和Western blotting檢測非梗死區(qū)心肌組織，結(jié)果顯示在心肌梗死后28 d，MI組Fas和caspase－3蛋白表達與sham組比較明顯增加，與上述結(jié)果相符。而芪藶強心組與MI組比較，F(xiàn)as和caspase－3蛋白表達顯著降低，表明芪藶強心明顯抑制了非梗死區(qū)心肌組織fas基因和caspase－3的表達。

芪藶強心抑制心肌細胞凋亡的細胞與分子生物學機制至今未明，可能通過降低舒張末壓，減輕室壁張力而減少心肌細胞凋亡;也可能與抑制缺血心肌產(chǎn)生大量ROS有關(guān)。ROS包括、OH·、H2O2、單線態(tài)氧(1O2)等，由缺血心肌通過級聯(lián)反應大量生成，可直接破壞核酸結(jié)構(gòu)，促進氧化應激敏感的凋亡基因(如fas、p53)的表達，激活細胞炎癥因子網(wǎng)絡如絲裂原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)等介導心肌細胞凋亡［14］。業(yè)已證實，抗氧化治療可以抑制梗死后心肌細胞凋亡和改善心功能［4］，而直接清除H2O2可以抑制梗死后心室重構(gòu)及功能紊亂［15］。XO是心肌組織中產(chǎn)生ROS的主要酶源之一，在缺血心肌中表達增加和活性增強［4－5］，而芪藶強心膠囊中有效成分如人參能夠抑制XO的活性［8］，而黃芪和丹參則能夠抑制氧化應激［9－10］。本研究用清除和OH·活性反映ROS的生成量，清除活性高則表明心肌組織中和OH·含量低;另測定XO活性及蛋白表達。結(jié)果芪藶強心組心肌組織清除和OH·活性明顯升高，XO活性降低，蛋白表達與MI組比較無顯著差異。據(jù)此推測芪藶強心可能通過抑制XO活性，減少ROS的生成，從而抑制氧化應激敏感的fas基因和caspase－3的表達，減少心肌梗死后非梗死區(qū)的心肌細胞凋亡而發(fā)揮作用，而對XO蛋白的表達無明顯影響。

心肌細胞凋亡受多種因素調(diào)控，芪藶強心還可能通過其它途徑抑制心肌細胞凋亡，如通過抑制p53基因的表達，降低應激激活蛋白激酶(stress activated protein kinase，SAPK)的活性，還可通過抑制凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)等途徑減少心肌細胞凋亡，這些都有待進一步的研究。

［1］Shah AM，Mann DL.In search of new therapeutic targets and strategies for heart failure:recent advances in basic science［J］.Lancet，2011，378(9792):704 － 712.

［2］Zhu YZ，Zhu YC，Wang ZJ，et al.Time－dependent apoptotic development and pro－apoptotic genes expression in rat heart after myocardial infarction［J］.Jpn J Pharmacol，2001，86(3):355 －358.

［3］Takemura G，F(xiàn)ujiwara H.Role of apoptosis in remodeling after myocardial infarction［J］.Pharmacol Ther，2004，104(1):1－16.

［4］Gladden JD，Ahmed MI，Litovsky SH，et al.Oxidative stress and myocardial remodeling in chronic mitral regurgitation［J］.Am J Med Sci，2011，342(2):114 －119.

［5］Berry CE，Hare JM.Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease:molecular mechanisms and pathophysiological implications［J］.J Physiol，2004，555(3):589 －606.

［6］馬芳放，路鳳月，馮書文.芪藶強心膠囊對慢性心力衰竭患者血管內(nèi)皮功能及心功能的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17(17):2602－2603.

［7］Xiao H，Song Y，Li Y，et al.Qiliqiangxin regulates the balance between tumor necrosis factor－alpha and interleukin－10 and improves cardiac function in rats with myocardial infarction［J］.Cell Immunol，2009，260(1):51 －55.

［8］Shen L，Han JZ，Li C，et al.Protective effect of ginsenoside Rg1 on glutamate － induced lung injury［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28(3):392 －397.

［9］岳曉莉，李 萍，劉 欣，等.黃芪多糖對過氧化氫刺激皮膚成纖維細胞中線粒體和溶酶體的保護作用［J］.中國病理生理雜志，2008，24(4):777－782.

［10］許晶蘭，王孝銘，王東霞.復方丹參滴丸對過氧化氫損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的保護作用［J］.中國病理生理雜志，2006，22(5):929－932.

［11］Sam F，Sawyer DB，Chang DL，et al.Progressive left ventricular remodeling and apoptosis late after myocardial infarction in mouse heart［J］.Am J Physiol，2000，279(1):H422－H428.

［12］李震東，馬清涌，羅羽宏.Fas/FasL介導的caspase－3活化與急性胰腺炎腺泡細胞凋亡的關(guān)系［J］.中國病理生理雜志，2009，25(6):1197－1201.

［13］Holly TA，Drincic A，Byun Y，et al.Caspase inhibition reduces myocyte cell death induced by myocardial ischemia and reperfusion in vivo［J］.J Mol Cell Cardial，1999，31(9):1709－1715.

［14］Krijnen PA，Nijmeijer R，Meijer CJLM，et al.Apoptosis in myocardial ischemia and infarction［J］.J Clin Pathol，2002，55(11):801－811.

［15］Matsushima S，Ide T，Yamato M，et al.Overexpression of mitochondrial peroxiredoxin－3 prevents left ventricular remodeling and failure after myocardial infarction in mice［J］.Circulation，2006，113(14):1779－1786.