烏司他丁聯(lián)合血必凈對(duì)內(nèi)毒素致綿羊多臟器功能障礙綜合征的防治研究

牛廷獻(xiàn)，萬(wàn)東君，王春雨，陸 璐，王紅義，羅曉紅

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科，蘭州 730050)

多臟器功能障礙綜合征 (multip le organ dysfunction syndrome，MODS)指在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克等原發(fā)病發(fā)生24h后，同時(shí)或序貫出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上系統(tǒng)器官功能不全的綜合征。它具有發(fā)病急、進(jìn)展快、病死率高的特點(diǎn)，是ICU患者最重要的死亡原因［1］。盡管近30年對(duì)其發(fā)病機(jī)制和防治研究進(jìn)行了深入探索，但仍未獲得臨床滿意的防治效果。烏司他丁(ulinastain，UTI)是肝臟分泌的一種糖蛋白［2］，是典型的廣譜蛋白酶抑制劑，在早期可阻斷全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)向 MODS發(fā)展。血必凈(XUEBIJING，XBJ)具有拮抗內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)、抗炎、改善免疫功能、保護(hù)組織細(xì)胞的作用［3，4］。本研究利用 LPS建立綿羊MODS模型，并利用烏司他丁聯(lián)合血必凈對(duì)其防治效果進(jìn)行研究，以探討 MODS的發(fā)病機(jī)制及防治措施。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與分組

50只杜泊綿羊(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(軍)2009-022)，雌雄各半，體重(20±1.5)kg，隨機(jī)分為：對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、烏司他丁組(C組)、血必凈組(D組)和烏司他丁+血必凈組(E組)，每組各10只。全價(jià)飼料飼養(yǎng)。

1.2 模型建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均用速眠新Ⅱ號(hào)(1.5m L/kg)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究 長(zhǎng)春，吉獸藥試字(2004) 005013)肌注麻醉后，LPS(血清型為：O127：B8，批號(hào)為64H4010，美國(guó) Sigma公司)按6μg/kg于30m in內(nèi)經(jīng)前肢橈靜脈泵入。

1.3 防治方法

動(dòng)物全麻后，在靜脈泵入LPS前1h，C組、D組和E組分別靜脈滴注UTI(3000U/kg)、XBJ(2m L/kg)和UTI+XBJ。之后，均1次/d，連續(xù)3d。同時(shí)，A組和B組靜脈滴注同劑量的生理鹽水。檢測(cè)指標(biāo)采樣時(shí)，0h和3h時(shí)綿羊處于麻醉狀態(tài)，其余為清醒狀態(tài)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

所有指標(biāo)的檢測(cè)均由本院檢驗(yàn)科完成。

1.4.1 血?dú)夥治?LPS靜脈泵入后，各組分別于0h、1h、2h、3h和6h經(jīng)股動(dòng)脈采血，立即測(cè)定氧分壓(PaO2)。

1.4.2 血常規(guī)和血清生化指標(biāo)的測(cè)定 各組分別于0h、3h、6h、12h、24h、48h和72h經(jīng)頸靜脈采血，測(cè)定WBC數(shù)目和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)和肌酐(CRE)。

1.5 MODS的診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照胡森等［7］提出的動(dòng)物發(fā)生 MODS時(shí)各個(gè)器官功能障礙分期診斷標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。在靜脈泵入LPS后出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上器官或系統(tǒng)功能障礙判定為MODS。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 體征表現(xiàn)及死亡率

B組綿羊靜脈泵入 LPS 2h后，出現(xiàn)呼吸頻率加快，心率快而不齊，3h后腹脹，尿頻，不能站立，運(yùn)動(dòng)障礙。E組較B、C和D組的體征表現(xiàn)明顯減輕，C、D組較 B組有所減輕，但不明顯。A組無(wú)明顯體征改變。24h后，B、C、D和 E組分別有6只、4只、5只和2只綿羊因呼吸窘迫、心律失常、血壓下降，繼之心衰死亡。A、B、C、D和E四組綿羊的死亡率分別為 0%、60%、40%、50%和20%。結(jié)果表明，烏司他丁聯(lián)合血必凈較其單獨(dú)應(yīng)用能明顯改善LPS誘導(dǎo)的動(dòng)物體征表現(xiàn)、降低死亡率。

2.2 血?dú)夥治?/p>

靜脈泵入LPS后，B、C、D和E組1～3h動(dòng)脈氧分壓(PaO2)(mmHg)與A組相比均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)，氧合指數(shù)［PaO2/FiO2(吸入氧濃度)］均(26.70kPa(1kPa=7.5mmHg)。E組與B、C和 D三組相比，只在6h時(shí) PaO2明顯升高(P＜0.05)，其他時(shí)點(diǎn)雖升高，但組間相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)表1)。結(jié)果表明，靜脈泵入LPS后，B、C、D和E組1～3h的氧合指數(shù)已達(dá)到急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。早期應(yīng)用烏司他丁聯(lián)合血必凈對(duì)肺功能有所改善。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)血?dú)獗容^Tab.1 The blood gas analysis in different time in each group

2.3 血清生化指標(biāo)的變化

靜脈泵入LPS后結(jié)果表明：(1)AST：B、C、D和E組6h～72h的水平與A組相比明顯或顯著升高(P＜0.05或 P＜0.01)，24h時(shí)達(dá)到峰值。12h～72h，與B組相比，C組和E組的水平明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)；與C組相比，D組在24h～72h時(shí)，其水平明顯升高(P＜0.05)，而E組則在48h～72h時(shí)明顯降低(P＜0.05)；與D組相比，在24h～72h時(shí)，E組的水平明顯下降(P＜0.05)。(2) ALT、TBIL和 CRE：三者的變化趨勢(shì)基本相同。在不同時(shí)點(diǎn)，B、C、D和E組三者的水平明顯高于A組(P＜0.05或P＜0.01)；B、C、D和E四組間的水平相比，C、E兩組較B、D組明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。C、E兩相比，E組較C組雖有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)表 2)。以上結(jié)果表明，靜脈泵入LPS后成功地建立了MODS模型。單獨(dú)應(yīng)用烏司他丁或二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的多臟器損傷具有明顯的干預(yù)作用。

2.4 血常規(guī)變化

血常規(guī)結(jié)果表明(見(jiàn)圖1)，靜脈泵入 LPS后，B、C和D和E組3h～6h WBC數(shù)目與A組相比明顯下降(P＜0.01)，6h后開(kāi)始上升，至24h后驟然升高。24h～72h，B、C和D和E四組WBC數(shù)目與A組相比明顯升高(P＜0.01)。48h～72h，B、C、D和E四組間WBC數(shù)目相比，E組較其他三組明顯降低(P＜0.01)，C組較 B組明顯降低(P＜0.05)，C組較D組WBC數(shù)目雖有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果表明，烏司他丁聯(lián)合血必凈盡管未能有效地干預(yù)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的MODS WBC數(shù)目驟然降低或升高，但對(duì)多臟器損傷的炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用。

圖1 不同時(shí)點(diǎn)各組WBC的變化Fig.1 The change of WBC in each group at different time

3 討論

MODS動(dòng)物模型是研究MODS發(fā)病機(jī)制和臨床防治的基礎(chǔ)，同時(shí)也是研究的一個(gè)難點(diǎn)。MODS是多因素誘發(fā)的臨床綜合征，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，再加上治療因素的干擾，使得模擬MODS的病理和臨床特征變化十分困難。因此，建立簡(jiǎn)單且符合臨床實(shí)際的MODS動(dòng)物模型一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索的課題。內(nèi)毒素介導(dǎo)的MODS模型具有致傷因素單一、造模方法簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果便于分析等優(yōu)點(diǎn)。大鼠、兔、綿羊和犬等動(dòng)物均可用于建立 MODS模型［9-12］，但不同動(dòng)物對(duì)LPS敏感性不同，而綿羊是復(fù)制MODS模型較為理想的動(dòng)物，在小劑量LPS作用下就能形成SIRS，繼而誘發(fā) MODS［13］。另一方面，綿羊?yàn)榇笮蛣?dòng)物，便于實(shí)驗(yàn)觀察血流動(dòng)力學(xué)、氧代謝和肺機(jī)械力學(xué)的改變，而且其病理生理變化與人相近［14］。因此，本研究選擇靜脈泵入小劑量 LPS建立綿羊MODS模型。

UTI是于1909年由Beuer和Reich在人尿液中發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中，UTI通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞炎性因子以保護(hù)器官免受損傷［15］。1985年正式應(yīng)用于臨床［16］。主要用于治療急性胰腺炎、急性肺損傷、ARDS、SIRS以及減輕圍術(shù)期臟器功能的損傷等［17］。它是一種單鏈多肽糖蛋白，具有廣譜的酶抑制作用，既能抑制胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、彈力蛋白酶、緩激肽等多種蛋白分解酶，又能有效抑制磷脂酶，還能穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜，清除氧自由基，減少炎癥因子的釋放和具有免疫調(diào)節(jié)作用。血必凈注射液屬國(guó)家中藥保密品種，其有效成分提取自紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸中，包括紅花黃色素A、川芎嗪、丹參素、阿魏酸、芍藥苷、原兒茶醛等，由我國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救醫(yī)學(xué)奠基人王今達(dá)教授根據(jù)“三證三法”辨證原則及“菌毒并治”理論［18］，以王清任血府逐瘀湯組方為基礎(chǔ)研制的靜脈制劑，具有活血化瘀、扶正固本、清熱解毒、菌毒并治等功效。在各臟器損傷的治療中發(fā)揮了拮抗內(nèi)毒素、清除氧自由基［19-21］、保護(hù)血管內(nèi)皮［22，23］、抗炎性介質(zhì)［24-27］、調(diào)節(jié)免疫功能［28，29］等作用。血必凈通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)集聚、過(guò)度活化、呼吸爆發(fā)，減少氧自由基，從而急性肺損傷起到了一定的保護(hù)作用。同時(shí)，它能夠有效改善慢性肺心病心功能不全患者的血液流變性，提高 PaO2、降低PaCO2，改善呼吸狀態(tài)，改善心臟收縮功能［30］。本研究正是基于二者的上述作用將其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)LPS誘導(dǎo)的MODS進(jìn)行防治研究。

本研究靜脈泵入LPS后，從模型組綿羊的體征表現(xiàn)、死亡率、PaO2及血清生化指標(biāo)和WBC數(shù)目明顯改變的結(jié)果表明，成功地建立了綿羊 MODS模型。同時(shí)表明，烏司他丁聯(lián)合血必凈較其單獨(dú)應(yīng)用能明顯改善LPS誘導(dǎo)的動(dòng)物體征表現(xiàn)、降低死亡率、早期應(yīng)用對(duì)肺功能有所改善。血清生化指標(biāo)結(jié)果表明，單獨(dú)應(yīng)用烏司他丁及其聯(lián)合血必凈，在不同時(shí)點(diǎn)均能明顯降低AST、ALT、TBIL和CRE的水平(P＜0.05)，而血必凈未能明顯降低這四者的水平。表明烏司他丁能有效地拮抗內(nèi)毒素，防治肺、肝、腎等臟器的損傷。至于單獨(dú)應(yīng)用血必凈為何未能達(dá)到明顯的干預(yù)效果?可能是其應(yīng)用劑量及時(shí)機(jī)不妥，這有待進(jìn)一步的研究。

血常規(guī)變化趨勢(shì)表明，靜脈泵入LPS后，WBC數(shù)呈“勺型”波動(dòng)變化，B、C、D和E四組3h～6h均明顯下降(P＜0.01)，6h后開(kāi)始上升，至24h后驟然升高(P＜0.05或P＜0.01)，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［31，32］。這可能是LPS對(duì)WBC具有急劇殺傷作用或抑制WBC的增殖，使得WBC數(shù)目在短時(shí)間內(nèi)明顯下降。之后形成的SIRS又使得WBC數(shù)目急劇升高。同時(shí)，48h～72h這四組組間 WBC數(shù)目相比，烏司他丁聯(lián)合血必凈組(E組)較其他三組明顯降低(P＜0.01)?？赡苁嵌咄ㄟ^(guò)抑制炎癥反應(yīng)的程度，減少了應(yīng)激性WBC升高，進(jìn)而減輕了LPS造成的損傷。

本研究結(jié)果表明，二者聯(lián)合應(yīng)用能減輕內(nèi)毒素所致的綿羊MODS的肺、肝、腎等臟器的損傷，減輕內(nèi)毒素繼發(fā)的全身炎癥反應(yīng)，早期應(yīng)用有助于降低MODS的病死率，但血必凈的劑量及給予時(shí)機(jī)有待進(jìn)一步研究。

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