HPLC法測定潤肺止咳片中黃芩苷的含量

李耀興

（吉化集團公司總醫(yī)院，吉林 吉林 132021）

HPLC法又常稱為高壓液相色譜法，是由經(jīng)典液相色譜法發(fā)展而來的一種新型的液相柱色譜。HPLC與后者不同之處在于流動相由原來的常壓輸送改為高壓輸送，采用小顆?；蛱厥獗砻嬖O(shè)計的柱填料代替原來的大顆粒、不規(guī)則多孔填充物，從而使流動相流速加快，分離效果大大提高。HPLC并配有各種檢測器，能靈敏地檢出柱中流出物的組分與含量，使分離與測定組成一個統(tǒng)一系統(tǒng)。在HPLC過程中，流動相溶劑被泵從貯液器中吸入，然后輸出，經(jīng)壓力和流量測量后進入送樣器，被分析樣品由此處注入，并隨流動相一起依次通過保護柱（并非必需部件）、分離柱后進入檢測器，檢測信號由微處理機采集和進行數(shù)據(jù)處理，或用積分儀、記錄儀記錄色譜峰面積和色譜圖。如果以制備為目的可用餾分收集器。遇有復(fù)雜樣品可以借助于梯度控制器進行梯度洗脫。整個HPLC儀器也可用一臺電子計算機加以操縱[1]。

1 儀器與試劑

島津LC-2010A高效液相色譜儀，色譜工作站。2011色譜工作站，潤肺止咳膠囊由青海大地藥業(yè)有限公司提供（批號：091108、091109、091110），黃芩苷對照品購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇（天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司），水（二次重蒸水，自制），磷酸（北京化工廠），流動相所用的試劑為色譜純，其他試劑、試藥均為分析純[2,3]。黃芩片由黃芩單味中藥材組成，具有抗菌、消炎的作用，臨床常用于上呼吸道感染、痢疾等，效果良好。原質(zhì)量標準收載于《部頒標準》中成藥分冊第2冊，無含量測定項，為控制本品的質(zhì)量，采用高效液相色譜法測定黃芩有效成分黃芩苷的含量[4,5]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

①供試品溶液的制備：精密稱取按處方比例配制的麻杏止咳片粉適量（相當于含鹽酸麻黃堿24mg），置小燒杯中，加入氨水與乙醚試液（3∶20）10min攪拌，濾入分液漏斗中，洗滌殘渣，洗滌液并入分液漏斗中，用0.5mol/l。鹽酸萃取，鹽酸萃取液轉(zhuǎn)移到100mL。量瓶中，稀釋至刻度，即得供試品溶液。②對照品溶液的制備：精密稱取鹽酸麻黃堿約24mg，置100mL。量瓶中，加0.5mol/L鹽酸溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得對照溶液。③紫外吸收光譜的測定：以0.5mol/L鹽酸作空白，分別測定對照品溶液及供試品溶液的紫外吸收光譜。

2.2 陰性對照試驗

取適量待測沖劑，研磨后過60目篩，精密稱定細粉1g，于100mL量瓶中，加適量80%乙醇，超聲振蕩10min，取上清液，經(jīng)適當稀釋后，用0.45μm的濾膜過濾，進樣10μL，外標法定量[6,7]。

2.3 線性范圍測定

將黃芩苷按照對照品溶液分成2、4、6、8、10μL，注入液相色譜儀，精密量取止咳卡，用乙醇萃取掉脂溶性雜質(zhì)與有機酸等，然后過大孔樹脂柱洗去混存的色素、糖等水溶性雜質(zhì)。結(jié)果表明，黃芩苷在0.4056～2.0280μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 黃芩苷對照品線性關(guān)系考察測定結(jié)果

2.4 精密度試驗

精密吸取黃芩苷對照品溶液5μL，重復(fù)進樣5次，結(jié)果峰面積平均值為1809，RSD=0.70%。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取對照品溶液5μL，每隔一定時間依法測定峰面積，結(jié)果RSD=1.35%，黃芩苷在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批樣品，精密稱取5份，依法測定黃芩苷含量，結(jié)果平均值5.44mg/粒，RSD=0.37%。測定結(jié)果表明，黃芩苷含量測定結(jié)果重現(xiàn)性良好。

2.7 回收率試驗

采用加樣回收法，精密稱取已知含量的潤肺止咳膠囊（含量5.1mg/粒，14.57mg/g）0.15g，再精密加入黃芩苷對照品溶液（0.2028mg/mL）10mL及50%甲醇40mL，按上述方法制備樣品溶液，測定含量，計算回收率。

2.8 樣品測定

取3批樣品，按上述方法制備供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液及對照品溶液各5μL，依法進樣，測定，計算。

3 討 論

適用于可溶于水并具可解離特性的化合物如蛋白質(zhì)、肽以及弱酸、弱堿類化合物，緩沖液及其pH的不同會影響組分的保留值，常用的緩沖液有三乙胺磷酸鹽溶液、磷酸鹽溶液、醋酸鹽溶液等，選用的pH應(yīng)使溶質(zhì)盡可能成為非解離形式，以使固定相有較大的保留能力[8,9]。流動相中加入某些電解質(zhì)或電荷與樣品相同的競爭性修飾劑往往可改善分離效果，據(jù)推測，這種修飾劑能覆蓋在鍵合相表面的殘余硅醇基上面，減少樣品與硅醇基的相互作用，增加或減少修飾劑的量可縮短或延長tR值。和其他色譜過程一樣，HPLC過程是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次的交換過程，它借助溶質(zhì)在兩相的分配系數(shù)、吸附能力、親和力、離子交換和分子大小不同引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得到分離。但在HPLC中的流動相是液體，又稱沖洗溶劑或載液。以液相分配色譜為例，開始，溶質(zhì)加在柱頭，隨流動相一起引入色譜柱，接著在固定相和流動相之間分配，分配系數(shù)大的組分在固定相上滯留時間較長，流出色譜柱較晚，分配系數(shù)小的組分不易被固定相滯留，流出色譜柱較早。若一含有多組分的混合物進入色譜系統(tǒng)，則混合物中各組分別按其在兩相間的分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱。不同組分在色譜過程中的分離情況取決于不同組分在兩相的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差別。本實驗針對水煎煮法對提取黃芩苷工藝進行研究，對其他提取溶劑的試驗沒有涉及。該研究展示了良好的前景，值得進一步研究。

[1]呂東,楊鳳梅.HPLC 測定潤肺止咳膠囊中黃芩苷含量[J].中成藥,2003,25(7):599-600.

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[4]陳靜,周紅艷.HPLC 法測定銀黃含化片中黃芩苷的含量[J].海峽藥學(xué),2009,21(6):84-85.

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