紫檀芪對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系增殖及凋亡的影響

黃海進(jìn)，焦 峰，何秀芝

(中國(guó)人民解放軍第82醫(yī)院，江蘇淮安223001)

乳腺癌是常見(jiàn)且高發(fā)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害女性健康，目前治療主要通過(guò)手術(shù)和放化療，而大多化療藥物都有嚴(yán)重的不良反應(yīng)［1～3］。一些天然物質(zhì)(白藜蘆醇、青蒿琥酯、雷公藤內(nèi)酯醇等)由于有抗腫瘤作用且?guī)缀鯚o(wú)不良反應(yīng)，近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越重視其在抗乳腺腫瘤方面的研究和應(yīng)用［4，5］。目前關(guān)于白藜蘆醇抗腫瘤效果和機(jī)制的研究很多，其可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。紫檀芪(PTE)廣泛存在于多種小漿果和紅酒中，其與白藜蘆醇都屬于芪類化合物。研究表明，甲基化的芪類化合物比羥基化的芪類化合物具有更高的生物活性。PTE除具有降血脂、降血糖、抗氧化作用，還能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。目前關(guān)于PTE治療乳腺癌的研究尚無(wú)報(bào)道，2010年2月～2011年10月，本研究將以體外培養(yǎng)的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系作為研究對(duì)象，觀察PTE對(duì)其增殖及凋亡的影響，從而為臨床藥物治療乳腺癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和材料 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)。PTE(Santa Cruz公司，美國(guó))，Caspase-Glo?3/7定量試劑盒(Promega公司，美國(guó))，TUNEL檢測(cè)試劑盒(碧云天公司，上海)，DMEM低糖培養(yǎng)液(Hyclone公司，美國(guó))，胎牛血清(杭州四季青公司)，MTT、胰蛋白酶、DMSO(Sigma，美國(guó))。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備儀器廠，蘇州)，倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)，ZW-A微量振蕩器(常州國(guó)華公司，常州)，低速離心機(jī)(Beckman Coulter公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 d。細(xì)胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要細(xì)胞接種于不同的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞長(zhǎng)到實(shí)驗(yàn)需要的密度，換用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)24 h，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)不同濃度PTE對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)分為5組(對(duì)照組，PTE 10、20、40、80 μmol/L組)，每組10個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞孵育24、48、72 h后，棄去培養(yǎng)液，加入100 μL的DMEM和10 μL的0.5%MTT，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，加入100 μL的DMSO原液，振蕩5 min，使結(jié)晶完全溶解，然后用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)為490 nm)測(cè)定吸光值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞黏附能力 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)報(bào)道［7］，稍作改動(dòng)。具體如下:將細(xì)胞種于75 mL培養(yǎng)瓶中，各組處理結(jié)束后，PBS洗3遍，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心、重懸，每組細(xì)胞計(jì)數(shù)1×105/mL，種于96孔板，每組10個(gè)復(fù)孔。接種0.5 h后棄去培養(yǎng)液和未貼壁的細(xì)胞，加入100 μL的DMEM和10 μL的0.5%MTT，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，然后倒置顯微鏡拍照，不同觀察者對(duì)同一視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 制作各組細(xì)胞爬片，處理結(jié)束后4%的多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌(5 min×3次)，0.1%的Triton X-100打孔5 min，PBS洗滌(5 min×3次)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，按每玻片2 μL的TdT酶、48 μL的熒光標(biāo)記液配制TUNEL檢測(cè)液，操作過(guò)程中嚴(yán)格避光。每張玻片加50 μL的TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min，PBS洗滌(5 min×3次)。用石蠟封片后熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光為染色陽(yáng)性，隨意選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.2.5 Caspase3/7活性測(cè)定 96孔板內(nèi)的各組細(xì)胞處理結(jié)束后，加入Caspase-Glo?3/7工作液，每孔100 μL，室溫下避光孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。凋亡系數(shù)設(shè)為:實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100%。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示。差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，比較2組間差異用t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果 不同濃度 PTE(10、20、40、80 μmol/L)孵育24、48、72 h后細(xì)胞存活率，見(jiàn)表1?？梢?jiàn)PTE可以有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，并呈濃度時(shí)間依賴性。

表1 不同濃度PTE處理24、48、72 h后對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

2.2 黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各組細(xì)胞經(jīng)48 h處理，黏附0.5 h后細(xì)胞染色所得顯微鏡下照片(插頁(yè)Ⅱ圖12)。對(duì)照組、10 μmol/L PTE組、20 μmol/L PTE組、40 μmol/L PTE組、80 μmol/L PTE組細(xì)胞數(shù)分別為696.8±11.2、374.5±9.3、273.2±8.1、224.3 ±6.6、162.2±5.1個(gè)/視野。結(jié)果表明PTE可以有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞的黏附能力(P＜0.01)，并呈濃度依賴性。

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組、10 μmol/L PTE組、20 μmol/L PTE組、40 μmol/L PTE組、80 μmol/L PTE組細(xì)胞凋亡率分別為 2.04% ± 0.76%、19.63% ±3.48%、34.23% ±2.95%、42.44%±2.57%、56.40% ±2.38%。與對(duì)照組比較，不同濃度PTE可以有效誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡(P＜0.01)，并呈濃度依賴性。見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖13。2.4 Caspase3/7活性測(cè)定 對(duì)照組、10 μmol/L PTE組、20 μmol/L PTE組、40 μmol/L PTE組、80 μmol/L PTE組 Caspase3/7活性分別為 100%、193.6% ±6.4%、272.8% ±12.7%、441.5% ± 19.3%、625.9%±40.4%。與對(duì)照組比較，不同濃度PTE可以使MDA-MB-231細(xì)胞Caspase3/7活性升高(P＜0.01)，并呈濃度依賴性。

3 討論

隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平提高，乳腺癌的發(fā)病率和病死率都呈迅猛上升趨勢(shì)，有報(bào)告顯示乳腺癌已成為我國(guó)婦女發(fā)病率第一和病死率第二的惡性腫瘤［8］。乳腺癌手術(shù)治療雖然有一定的治療效果，但是手術(shù)后化療及手術(shù)切口會(huì)給廣大女性帶來(lái)很大的生理和心理的痛苦，嚴(yán)重危害女性健康和家庭的穩(wěn)定［1］。因此，人們?cè)絹?lái)越重視天然物質(zhì)在抗乳腺腫瘤方面的研究和應(yīng)用。

PTE廣泛存在于自然界中，是植物在受到外來(lái)侵害時(shí)所產(chǎn)生的一種抗體性物質(zhì)，是一種植物抗毒素。研究證實(shí)PTE對(duì)肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤具有抗癌活性［9～11］。本研究通過(guò)MTT和黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PTE可以顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的存活率和黏附能力，并表現(xiàn)為藥物濃度和作用時(shí)間依賴性。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系［12，13］。大量研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡與乳腺癌的關(guān)系非常密切，并直接影響其預(yù)后［7，8］。Caspase3/7屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，它的激活是細(xì)胞進(jìn)入凋亡階段最關(guān)鍵的因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，PTE在抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡同時(shí)，可明顯上調(diào)Caspase3/7活性。據(jù)此我們推斷，PTE正是通過(guò)對(duì)凋亡信號(hào)通路的影響發(fā)揮抗乳腺癌的作用。

研究證實(shí)，PTE的多種生物活性優(yōu)于或至少不低于白藜蘆醇［14］。更值得一提的是，PTE作為天然物質(zhì)，其藥物安全范圍很大，較傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物其基本無(wú)不良反應(yīng)［19］?？梢?jiàn)，PTE在乳腺癌藥物治療領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的研究和開(kāi)發(fā)前景。

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