徐 健,項(xiàng)洪剛,易 偉,查思洛
(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院,上海200003)
反映區(qū)域淋巴結(jié)侵犯情況的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率(LNR)是影響大腸癌預(yù)后的ⅠA類決定因子[1],也是判斷是否行術(shù)后輔助治療的主要依據(jù)。大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散是一個(gè)涉及多因素、多階段的復(fù)雜過程,已有的研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶-9[2](MMP-9)和nm23[3]分別可能具有對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)受侵的促進(jìn)或保護(hù)作用。本研究以人結(jié)腸癌組織為對(duì)象,通過免疫組化染色觀察分析nm23和MMP-9的表達(dá),綜合分析二者與LNR的關(guān)系,以期能更好的評(píng)判LNR的風(fēng)險(xiǎn)度。
1.1 標(biāo)本來源 2007年1月~2011年12月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院結(jié)直腸外科收治并經(jīng)病理診斷的結(jié)腸癌患者567例?;颊呔鶠槭状谓邮苁中g(shù)治療,入選病例至少有1枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性,且送檢淋巴結(jié)數(shù)達(dá)12枚以上,剔除術(shù)前放化療病例。其中男366例、女201例,年齡23~92歲、中位年齡62歲。腫瘤分級(jí)按WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ級(jí)(高分化)238例,Ⅱ級(jí)(中分化)256例,Ⅲ級(jí)(低分化或未分化)73例。送檢淋巴結(jié)12~48(14.49±8.68)枚。收集患者性別、年齡及其病理資料等。
1.2 組織芯片免疫組化染色
1.2.1 組織芯片的制備 委托上海芯超生物科技有限公司使用組織陣列儀(美國Beecher公司)制作結(jié)腸癌組織芯片,操作流程按收集標(biāo)本、取材、脫水、石蠟包埋、4 μm切片、HE染色標(biāo)記和芯片制作處理。
1.2.2 免疫組織化學(xué)染色采用二步法 鼠抗人單克隆抗體 nm23(No:MAB-0139)和 MMP-9(No: MAB-0245)及二步法免疫組化試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。每次實(shí)驗(yàn)均以已知的陽性組織切片作為陽性對(duì)照,以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照,DAB顯色。
1.2.3 陽性結(jié)果判斷 用Mattern積分法[4]染色指數(shù)來評(píng)定陽性細(xì)胞百分率:每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野(×400):無陽性表達(dá)細(xì)胞為0分;<50% 為1分;50% ~75%為2分;>75%為3分。染色強(qiáng)度:0為不著色;1為淺黃色;2為深黃色;3為棕黃色。染色指數(shù)為陽性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度之和。陽性表達(dá)指數(shù)>3定為免疫組化染色陽性;≤3定為陰性。
1.3 LNR 將LNR(陽性淋巴結(jié)數(shù)/全部被檢淋巴結(jié)數(shù) ×100%)分為:LNR0(0),LNR1(<10%),LNR2(10%~25%),LNR3(>25%)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料組間采用χ2檢驗(yàn),多個(gè)變量相關(guān)性采用Spearman's等級(jí)相關(guān)分析,以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
2.1 結(jié)腸癌nm23和MMP-9的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌nm23和MMP-9陽性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色,主要定位于細(xì)胞質(zhì),呈彌漫分布,見插頁Ⅰ圖7、8,陽性表達(dá)率分別為51.9%和55.0%。兩者表達(dá)差異與患者的性別、年齡無關(guān)(P>0.05)。但低分化、浸潤至漿膜層/淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者,nm23表達(dá)陽性率明顯較低,而MMP-9表達(dá)陽性率則較高。結(jié)果表明nm23和MMP-9的表達(dá)與腫瘤分級(jí)程度、腸壁浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
2.2 nm23和 MMP-9的表達(dá)與 LNR的關(guān)系
Spearman相關(guān)分析顯示,LNR和腫瘤原發(fā)灶nm23表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.561,P<0.05),LNR與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.569,P<0.05)。并且nm23和MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.434,P<0.05)。
表1 nm23、MMP-9表達(dá)和結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系
結(jié)腸癌術(shù)后病理的LNR是判斷患者預(yù)后的重要獨(dú)立預(yù)后因子,也是確定術(shù)后輔助治療的主要依據(jù)[5]。美國癌癥聯(lián)合會(huì)和美國病理學(xué)家協(xié)會(huì)建議至少需檢出12枚淋巴結(jié)以上才能較為準(zhǔn)確判斷結(jié)腸癌的LNR。Wang等[6]的研究發(fā)現(xiàn),LNR是獨(dú)立的生存影響因子,優(yōu)于淋巴結(jié)陽性數(shù)預(yù)測(cè)預(yù)后,更是Ⅲ期結(jié)腸癌準(zhǔn)確的預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)。但是由于目前病理手段的局限性和存在病理醫(yī)師個(gè)人經(jīng)驗(yàn)的差異性,我們尚不能做到對(duì)所有患者LNR的精確判斷,尤其是對(duì)于常規(guī)HE染色難以發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)內(nèi)單個(gè)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞團(tuán)直徑≤2 mm的微小轉(zhuǎn)移。這就很可能導(dǎo)致對(duì)LNR的誤判,以至于影響腫瘤分期和后續(xù)輔助治療的決策,因此如何采用其他手段聯(lián)合病理結(jié)果來取得較為精確的LNR,是擺在外科和腫瘤科臨床醫(yī)師面前的一個(gè)較為重要的課題。
目前針對(duì)nm23基因[7]的研究比較廣泛。它包括nm23-H1和nm23-H2。以往的研究表明,它編碼的產(chǎn)物對(duì)癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和轉(zhuǎn)移潛能有抑制作用[8],結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤等的轉(zhuǎn)移與nm23蛋白表達(dá)低下有關(guān),其中的機(jī)理可能是通過nm23蛋白產(chǎn)物二磷酸核苷激酶(NDPK),參與體內(nèi)高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移,促進(jìn)細(xì)胞分裂,參與G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳遞,影響細(xì)胞內(nèi)微管的聚合和解聚來影響腫瘤細(xì)胞的活性。本研究顯示,低分化、浸潤至漿膜層、LNR高和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者nm23表達(dá)陽性率明顯較低,而且nm23的陽性表達(dá)率和LNR存在顯著的負(fù)相關(guān),表明nm23對(duì)大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用。
MMP-9是MMPs家族中的重要成員,其分子量最大,是Ⅳ型膠原酶,能夠降解、破壞細(xì)胞外基質(zhì)中最主要的成分Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原和明膠。大量研究表明,腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤的潛能與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9的能力有著密切的正相關(guān)關(guān)系,對(duì)腫瘤的黏附和能動(dòng)性有影響。在胃癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中均有MMP-9的顯著增高。這與本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果相一致,低分化、浸潤至漿膜層、LNR高和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中MMP-9表達(dá)陽性率明顯高于對(duì)照組。同樣LNR與腫瘤原發(fā)灶MMP-9表達(dá)呈顯著正相關(guān),而且nm23和MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
總之,通過本研究,我們推測(cè)大腸癌nm23表達(dá)缺失和MMP-9過高表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期階段就已發(fā)揮作用。因此對(duì)于 LNR0的大腸癌患者(Dukes A、B)原發(fā)灶中nm23和MMP-9聯(lián)合檢測(cè)有望成為評(píng)估LNR風(fēng)險(xiǎn)度的有用指標(biāo),并對(duì)臨床制定治療術(shù)后輔助措施和判斷預(yù)后有重要指導(dǎo)意義。
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