靶向結(jié)締組織生長因子的siRNA對于肝星狀細(xì)胞介導(dǎo)肝纖維化的研究進(jìn)展

樊雪強 陳新華 齊曉艷

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；2.呼和浩特市第二醫(yī)院肝病科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010

肝纖維化是在多種細(xì)胞因子如靶向結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）等作用下、各種慢性肝病進(jìn)展至肝硬化的共同通路。在此過程中，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）活化并分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）為重要病理生理基礎(chǔ)。因此，減少HSC活化、促進(jìn)ECM降解可逆轉(zhuǎn)肝纖維化。有研究表明，siRNA靶向干擾HSC的CTGF基因表達(dá)為肝纖維化治療開辟了新的途徑。現(xiàn)將HSC、CTGF及siRNA與肝纖維化的研究進(jìn)展綜述如下：

1 HSC

1.1 HSC概念及作用

對HSC的研究已有100 多年的歷史。1876年德國學(xué)者Kupffer首先用氯化金染色確認(rèn)出HSC，稱之為sternzellen，1971年Wake再次應(yīng)用氯化金染色證明Ito細(xì)胞即Kupffer所說的sternzellen[1]。HSC是功能多樣的肝內(nèi)非實質(zhì)細(xì)胞，故被命名為Ito細(xì)胞、貯脂細(xì)胞、竇周細(xì)胞、脂細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞或維生素A儲存細(xì)胞等[2]。

HSC大小介于肝細(xì)胞與庫普弗細(xì)胞（kupffer cell，KC）之間，中央帶較少，大多數(shù)排列于肝小葉的周圍，主要特點為形態(tài)不規(guī)則，胞體常延伸出形態(tài)各異的胞突包繞肝血竇，鄰近的HSC主要也是由延伸出的胞突相連接[3]。正常肝臟肝星狀細(xì)胞占肝內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的5%～15%，其主要功能是儲存維生素A、合成和分泌多種膠原酶和少量的ECM、釋放轉(zhuǎn)移生長因子 β （transfer growth factor-β，TGF-β） 及肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），并參與肝臟的物質(zhì)代謝[4]。 由于其細(xì)胞形態(tài)的可塑性及在立體空間的分布使其在調(diào)節(jié)肝血竇血流方面發(fā)揮重要作用[5]。

1.2 HSC活化

HSC活化是肝纖維化的病理變化中的重要事件[6-7]。在各種因素的刺激下，靜止的HSC活化、產(chǎn)生形態(tài)變化，由富含維生素A的狀態(tài)脫顆粒釋放出維生素A，這一過程稱為HSC的活化[4]。活化包括啟動及持續(xù)兩個階段。前者指早期在基因表達(dá)改變及細(xì)胞因子等刺激作用下細(xì)胞表型發(fā)生改變，由旁分泌機制參與；后者則是這些刺激因素維持HSC的活化表型，導(dǎo)致肝纖維化形成，既有旁分泌機制參與又有自分泌機制參與[8]。在啟動激活階段，在肝臟受到損傷后，HSC附近細(xì)胞如肝細(xì)胞、血小板、Kupffer細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、浸潤癌細(xì)胞等在旁分泌機制的作用參與下，釋放出一系列細(xì)胞因子，從而完成激活。活化的HSC具有以下生物學(xué)特征：①形態(tài)類似肌纖維母細(xì)胞；②增殖活性明顯增強；③胞質(zhì)中脂滴、維生素A減少或消失；④表達(dá)a-SMA（a-smooth muscle actin，a-SMA）、波形蛋白及結(jié)合蛋白等；⑤分泌ECM增加；⑥基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）合成和分泌增加；⑦收縮性增強等。大多數(shù)研究顯示，活化HSC主要以凋亡的方式消除，此為肝纖維化消退的主要機制[4]。

1.3 HSC與肝纖維化

肝纖維化是一種以ECM沉積為特點的可逆的肝損傷修復(fù)反應(yīng)[9]。在受損肝臟中，HSC是ECM的主要來源[10]。隨著各種因素進(jìn)一步作用在肝臟，激活的HSC由復(fù)雜的旁分泌與自分泌作用合成并分泌ECM，大量的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑抑制膠原酶、明膠酶等合成、釋放，ECM降解速率下降使ECM降解小于合成，最終導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)過度積聚形成肝纖維化[11]。但器官纖維化分子機制由于其復(fù)雜性尚未全面闡明[12]。近年來研究表明，肝細(xì)胞在急性和慢性肝損傷時所分泌表達(dá)的 Smad（solvent metal atoms scattered）亞型不同，導(dǎo)致 HSC在活化之后出現(xiàn)表型及功能的不同，此研究在某種程度上詮釋了在慢性肝病時肝臟中有不溶性ECM沉積導(dǎo)致肝纖維化甚至肝硬化的原因[13-14]。

2 靶向CTGF siRNA對肝纖維化的影響

在分子水平，肝纖維化過程由多種生長因子、細(xì)胞因子及金屬細(xì)胞因子驅(qū)使[15]。細(xì)胞因子是一種具有多種細(xì)胞調(diào)節(jié)功能、高活性的蛋白多肽分子，由成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，能夠?qū)SC增殖分化及ECM的合成產(chǎn)生影響，分為刺激因子和抑制因子兩大類。

CTGF是一種非結(jié)構(gòu)性基質(zhì)蛋白，能直接介導(dǎo)HSC活化、合成及分泌ECM[16-17]。在肝臟，CTGF是最受關(guān)注的CCN蛋白，它是TGF-β活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器并通過觸發(fā)ECM的合成、重建參與肝損傷的起始和持續(xù)過程[18]。CTGF和ECM可協(xié)同作用并且促進(jìn)細(xì)胞遷移、粘連、有絲分裂、生存及血管生成[19-20]。在組織肝纖維化過程中，CTGF主要涉及以下生物效能：具有有絲分裂原作用，促血管平滑肌細(xì)胞增殖；與其他細(xì)胞因子協(xié)同刺激ECM，抑制其降解、導(dǎo)致ECM的積累和結(jié)構(gòu)重建；介導(dǎo)細(xì)胞的黏附過程；促進(jìn)細(xì)胞趨化，在體外可趨化成纖維細(xì)胞。

研究表明，硬化組織的CTGF、TGF-β水平較正常組織表達(dá)增加6～8 倍，且此二者上升的水平與肝硬化發(fā)生、發(fā)展水平呈正相關(guān)。CTGF是TGF-β的下游效應(yīng)介質(zhì)，具有介導(dǎo)TGF-β促進(jìn)ECM效應(yīng)之作用。在白蛋白的控制下轉(zhuǎn)基因小鼠CTGF表達(dá)基因啟動子顯示在慢性CCl4干預(yù)下肝纖維化水平加劇[21]。各種體液（血清、血漿及尿液）中CTGF的測定已被用來評估纖維化的嚴(yán)重程度及重構(gòu)的過程。Kovalenko等[22]開發(fā)了一種新型檢測CTGF人血清三明治ELISA法以求驗證CTGF作為非侵入性標(biāo)志物的評估肝纖維形成的特殊過程和炎癥活動水平，并確認(rèn)與健康組對照，肝纖維化患者血清CTGF水平顯著升高。HSC激活后可產(chǎn)生CTGF；反之，CTGF又促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、遷移、黏附和ECM的產(chǎn)生，誘導(dǎo)纖維化的產(chǎn)生。研究證實，CTGF對HSC產(chǎn)生的ECM有調(diào)節(jié)作用，并能促進(jìn)HSC的遷移、增殖進(jìn)而促使HSC活化。

siRNA是一種基因沉默的強大工具[23]。siRNA介導(dǎo)的同源基因沉默高效且針對性強，能夠抑制同源基因表達(dá)，從而降低了相應(yīng)蛋白質(zhì)水平和功能。先前的研究展示siRNA序列和劑量依賴TGF-β1基因沉默抑制相應(yīng)的膠原蛋白合成[24]。

Li等[25]研究CTGF對于肝纖維化指標(biāo)表達(dá)的影響。其結(jié)果顯示，siRNA能顯著抑制原代 HSC激活并下調(diào)原代大鼠HSC表達(dá)CTGF基因的水平。李光明等[26]在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠的門靜脈注入CTGF siRNA，觀察其抗纖維化作用以及對積聚ECM的影響。其研究結(jié)果顯示，沉默CTGF對大鼠肝組織中Ⅳ型膠原、層黏連蛋白mRNA表達(dá)增加及外周血透明質(zhì)酸、Ⅴ型前膠原含量升高都有明顯的抑制效應(yīng)，肝纖維化程度的緩解主要取決于肝組織內(nèi)CTGF基因表達(dá)的下調(diào)。沉默CTGF siRNA基因?qū)Cl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有顯著的阻抑作用[27]。

大量動物實驗及體外細(xì)胞培養(yǎng)證實，靶向CTGF siRNA可抑制CTGF表達(dá)，抑制HSC活化、增殖以及ECM合成阻止肝纖維化進(jìn)展。George等[28]應(yīng)用Real-time PCR、免疫組織化學(xué)等方法在對體外培養(yǎng)HSC和動物肝纖維化模型的研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和CTGF基因的表達(dá)可被在siRNA介導(dǎo)下的CTGF基因沉默抑制，阻止HSC活化，下調(diào)結(jié)締組織蛋白積聚的水平。靶向CTGF siRNA可以高效、特異性地抑制大鼠HSCT6 中CTGF的基因表達(dá)，抑制效率在一定濃度和時間范圍內(nèi)具劑量依賴性增高及時間限制特性。靶向CTGF siRNA對原代干細(xì)胞和HSC中CTGF表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

Zhu等[29]的研究表明，序列特異性CTGF siRNA能明顯減少層粘連蛋白、透明質(zhì)酸及Ⅲ、Ⅳ型膠原等ECM的合成。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，靶向CTGF siRNA能夠減少Ⅰ、Ⅲ型膠原、TIMP和CTGF等的表達(dá)，抑制TGF-β1的促纖維化效應(yīng)，CTGF有可能是Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成抑制上游調(diào)控因素。在大鼠，CTGF siRNA治療成為CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化中HSC的特殊治療策略[30]。

3 展望

近年來眾多研究表明，由siRNA介導(dǎo)的CTGF基因沉默在肝纖維化的治療方面打開了嶄新的局面，開辟了新的途徑。CTGF siRNA特異性抑制CTGF表達(dá)的應(yīng)用，有望為治療肝纖維化提供新途徑。

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