知母多酚對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用

嚴(yán) 犇,劉 康,劉保林,黃 芳

中國(guó)藥科大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，南京 211198

知母為百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bunge.）的干燥根莖，具有抗菌解熱、降糖、降脂、抑制血小板聚集等作用。知母多酚（total phenol of Anemarrhena asphodeloides，TPAA）為其主要活性組分。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，知母多酚能顯著降低糖尿病動(dòng)物的血糖。本文通過(guò)知母多酚對(duì)內(nèi)皮保護(hù)作用的研究，探討其改善糖尿病心血管并發(fā)癥的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物及試劑

知母購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室吳啟南副教授鑒定確認(rèn)。知母用10倍量水煎煮2次，每次1h，放冷，過(guò)濾，濃縮至1 g· mL-1，加乙醇至含醇70%，過(guò)濾，回收乙醇，得流浸膏，再加水稀釋至0.5 g·mL-1、調(diào)pH值為3，正丁醇1/3體積萃取3次，得正丁醇層，調(diào)pH值為7，以水1/3體積萃取3次，得水層，調(diào)pH值為3，正丁醇1/ 3體積萃取3次，回收正丁醇，得知母多酚，收率為2%。以芒果苷（蘇州思源天然產(chǎn)物研發(fā)有限公司贈(zèng)送，純度99.5%以上）為對(duì)照，酒石酸亞鐵反應(yīng)比色法測(cè)定總酚含量為80%。經(jīng)HPLC法測(cè)得，多酚中主要成分為芒果苷和新芒果苷，見(jiàn)圖1。

牛血清白蛋白（BSA，南京生興生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：8C248C24）；棕櫚酸（palmitic acid，PA），用無(wú)水乙醇溶解、10%BSA稀釋成相應(yīng)濃度；胰島素注射液 （江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：1103240）；重酒石酸去甲腎上腺素注射液（NE，天津金耀氨基酸有限公司）；乙酰膽堿（Ach）、水楊酸鈉、D-葡萄糖、果糖、疊氮鈉均為分析純。

圖1 知母多酚HPLC測(cè)定結(jié)果峰13為芒果苷，峰7為新芒果苷

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC），購(gòu)于南京凱基生物有限公司。胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品。ELISA試劑盒，進(jìn)口分裝，南京迪兆生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號(hào)：0002359；動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持晝夜節(jié)律在室溫22±2℃中自由攝食和飲水。

1.3 儀器

JH-2肌張力傳感器、HW-400SE恒溫平滑肌槽、BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) （成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品）；RF-5301PC島津熒光分光光度計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)原始張力進(jìn)行測(cè)量分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，采用單因素方差分析和Student’s-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的制備

選取雄性SD大鼠，體重180～220 g，剪頭后迅速打開(kāi)胸腔取出胸主動(dòng)脈，置于通以95%O2+5%CO2混合氣體的K-H液中，仔細(xì)分離血管周?chē)M織，清除血管內(nèi)血液，剪成長(zhǎng)2～3 mm血管環(huán)，鋼鉤固定于含K-H液的浴皿中，并通過(guò)張力換能器連于生物機(jī)能記錄儀。給予血管環(huán)2 g左右的靜息張力，平衡60 min后，重復(fù)兩次加入高K+液，預(yù)收縮血管條，檢查標(biāo)本活性，然后用K-H液洗滌達(dá)基線。待動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定后，先以NE（1×10-6mol·L-1）收縮血管環(huán)，再分別用累進(jìn)劑量ACh（1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol· L-1）舒張血管，若加ACh后使NE預(yù)收縮的血管舒張幅度＞80%，認(rèn)為內(nèi)皮完整，可繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 知母多酚對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈舒張反應(yīng)的影響

取內(nèi)皮完整的主動(dòng)脈環(huán)，在K-H液中平衡后，分組處理：（1）正常組：繼續(xù)平衡60 min；（2）棕櫚酸損傷組：浴槽中加入棕櫚酸（100 μmol·L-1）溫育30 min；（3）知母多酚組：在加入棕櫚酸前30 min分別加入不同濃度的知母多酚 （10、100、300 μg·mL-1），觀察其對(duì)血管張力的影響；（4）水楊酸鈉組：在加入棕櫚酸前30 min加入5 mmol·L-1的水楊酸鈉。在上述各組繼續(xù)用NE（1×10-6mol·L-1）預(yù)收縮的基礎(chǔ)上，依次累進(jìn)加入胰島素 （1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol·L-1），每次間隔20 min，記錄血管張力變化曲線，觀察胰島素誘導(dǎo)的舒張百分比。

如圖2所示，棕櫚酸刺激下，由胰島素調(diào)節(jié)的內(nèi)皮依賴性血管舒張受到極大程度的抑制，證明造模成功。加入不同濃度知母多酚 （10、100、300 μg· mL-1）預(yù)處理后，胰島素調(diào)節(jié)的內(nèi)皮依賴性血管舒張得到明顯改善，其中高劑量組與棕櫚酸損傷組比較有顯著差異（*P＜0.05）。證實(shí)了知母多酚對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用及作用的濃度呈梯度依賴性。

圖2 知母多酚對(duì)棕櫚酸損傷主動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響正常組、水楊酸鈉組、知母多酚高劑量組與模型組相比，*P＜0.05

2.3 知母多酚對(duì)IL-6、TNF-α蛋白水平表達(dá)的影響

選用生長(zhǎng)良好的HUVEC，以5×105mL-1接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液1 mL，待細(xì)胞融合后，換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，使細(xì)胞同步化后即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：（1）正常組：用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基溫育HUVEC 24h；（2）棕櫚酸組：加入100μmol·L-1的棕櫚酸溫育HUVEC 24 h；（3）知母多酚組：先分別用10、100、300 μg·mL-1的知母多酚預(yù)溫育HUVEC 30 min，再加100 μmol·L-1的棕櫚酸共溫育HUVEC 24 h；（4）水楊酸鈉組：用5 mmol·L-1的水楊酸鈉預(yù)溫育HUVEC 30 min，再加入100 μmol·L-1的棕櫚酸共溫育HUVEC 24 h；無(wú)菌操作，吸取上清液，分裝，于-70℃低溫冰箱保存，ELISA試劑盒檢測(cè)。

如圖3、圖4所示，棕櫚酸刺激下，炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α較空白組明顯增加，知母多酚（10、100、300 μg·mL-1）能顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、TNF-α的釋放。說(shuō)明了知母多酚對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞的炎癥通路有關(guān)。

圖3 知母多酚對(duì)棕櫚酸刺激下內(nèi)皮細(xì)胞IL-6釋放的影響

圖4 知母多酚對(duì)棕櫚酸刺激下內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α釋放的影響

2.4 知母多酚對(duì)體外糖基化修飾蛋白質(zhì)的抑制試驗(yàn)

反應(yīng)液：BSA 0.5%、D-葡萄糖5 mmol、果糖5mmol、疊氮鈉0.02%，臨用前用PBS配制。將上述反應(yīng)液1.9mL分裝于2.0mL的試管內(nèi)，再加入不同濃度的知母多酚0.1mL（臨用前以PBS分別配制成1×10-2、8×10-3、6×10-3、4×10-3、2×10-3、1×10-3g·L-1），并將試管密封，置于37℃孵育各21天，形成糖基化修飾的白蛋白（AGE-BSA），陽(yáng)性藥為鹽酸氨基胍（10、5、1mmol·L-1），另設(shè)不加任何藥物的糖基化系統(tǒng)、無(wú)蛋白的空白組、無(wú)糖空白組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。利用AGE-BSA在激發(fā)波長(zhǎng)370/發(fā)射波長(zhǎng)450 nm有特征性吸收光譜，采用熒光光譜分析法測(cè)定其形成的AGE-BSA含量（激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm，靈敏度2，增益5，縫寬5 μm）。結(jié)果以熒光值表示，組間采用t檢驗(yàn)。

如表1所示，與模型組相比，陽(yáng)性藥氨基胍鹽酸鹽（10 mmol·L-1）的抑制率達(dá)到86.88%；知母多酚（10-2g·L-1）的抑制率達(dá)到99.29%，而知母多酚（10-3g·L-1）的抑制率也達(dá)到66.45%。說(shuō)明知母多酚能顯著抑制體外糖基化產(chǎn)物的生成。

表1 TPAA對(duì)蛋白質(zhì)體外糖基化終產(chǎn)物（AGEs）熒光值測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）是胰島素的靶器官之一

生理濃度下胰島素能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型NO合酶的表達(dá)，從而增加NO的釋放；亦可直接作用于血管平滑肌，使細(xì)胞膜超極化及Ca2+通道關(guān)閉，介導(dǎo)血管舒張。胰島素的這一生理活性對(duì)維持血管內(nèi)皮的正常功能起著關(guān)鍵作用，且胰島素介導(dǎo)的舒張血管活性作用具有內(nèi)皮依賴性[3]。游離脂肪酸可引發(fā)血管炎癥反應(yīng)，促進(jìn)粘附分子表達(dá)致炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等釋放，其中TNF-α通過(guò)增加活性氧的生成促使NO失活，從而降低血管內(nèi)皮依賴性舒張[4]。

本實(shí)驗(yàn)中用棕櫚酸刺激大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，胰島素介導(dǎo)的主動(dòng)脈環(huán)舒張作用顯著下降，NO釋放減少。知母多酚和水楊酸鈉都能有效改善棕櫚酸損傷的VEC依賴性血管舒張功能和VEC內(nèi)源性NO釋放。水楊酸鈉是炎癥反應(yīng)的有效抑制劑，并且能顯著恢復(fù)血管舒張功能。因此提示炎癥可能參與棕櫚酸作用于血管內(nèi)皮的反應(yīng)。

3.2 蛋白質(zhì)的非酶糖基化

蛋白質(zhì)的非酶糖基化是體內(nèi)的葡萄糖等酮糖與體內(nèi)多種蛋白質(zhì)，在高糖或氧化應(yīng)激條件下發(fā)生非酶催化的糖基化作用，生成可逆的Schiff堿，繼而重排生成穩(wěn)定的Amadori產(chǎn)物，再降解為α-酮醛復(fù)合物，生成棕褐色具有熒光性的糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）[5]。AGEs在組織中形成和沉積后，引起組織的老化和功能衰退，在眼晶狀體表現(xiàn)為白內(nèi)障；血管基底膜的糖基化則與糖尿病微血管病變等有關(guān)。低密度脂蛋白的糖基化修飾與高血脂癥、糖尿病心血管并發(fā)癥有密切關(guān)系。在糖尿病患者，糖基化的速度與正常人相比大大加快，與糖尿病微血管并發(fā)癥密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，知母多酚用藥組糖化蛋白明顯減少，提示其可能對(duì)體外的非酶糖基化反應(yīng)具有抑制作用。

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