大蒜素對痢疾桿菌抑菌作用及其機(jī)制的初步探討

楊杰等

【摘 要】目的：觀察大蒜素對痢疾桿菌的抑菌效果，初步探討大蒜素的抑菌機(jī)制。方法：采用K-B紙片法、液體稀釋法檢測大蒜素對痢疾桿菌的抑菌效果及最小抑菌濃度（MIC）值；采用SDS-PAGE電泳法，觀察大蒜素作用下菌體蛋白質(zhì)電泳圖譜的變化。結(jié)果：大蒜素對痢疾桿菌的抑菌環(huán)直徑為15.3±1.676305mm，MIC值為100ug/ml，在SDS-PAGE中，大蒜素作用后，痢疾桿菌的蛋白圖譜有變化。結(jié)論：大蒜素對痢疾桿菌有抑菌作用，并影響菌體蛋白質(zhì)的合成，初步揭示了大蒜素的作用機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】大蒜素；SDS-PAGE；抑菌機(jī)制；痢疾桿菌

志賀菌屬細(xì)菌通稱痢疾桿菌，是一類具有高度傳染性和危害嚴(yán)重的革蘭陰性腸道致病菌，臨床感染可導(dǎo)致細(xì)菌性痢疾（菌痢）。菌痢是世界上，尤其是發(fā)展中國家重要的傳染病之一，全球每年的病例超過1.6億，并導(dǎo)致100萬患者死亡，其中絕大數(shù)為5歲以下的兒童[1]。目前，人們長期濫用抗生素造成了嚴(yán)重菌群失調(diào)和藥物不良反應(yīng)，因此，尋找一種不良反應(yīng)少又有效的抗菌藥物，是醫(yī)學(xué)界努力的方向。大蒜為百合科植物，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，又具有很高藥用價值。原在法國、埃及等地早就用來佐餐、預(yù)防疫癘，秦漢時期傳人我國，我國食用大蒜及用大蒜治療疾病歷史悠久，據(jù)《本草綱目》記載，大蒜有解毒散臃腫、消毒氣、除風(fēng)破冷、健脾治世等功效[2]。研究表明，大蒜抗菌的有效成分是大蒜素。本研究主要觀察大蒜素對痢疾桿菌的抑菌作用，并對其抑菌機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1材料

大蒜素（江蘇正大清江制藥有限公司）；福氏痢疾桿菌（本室保存，菌號：51571-10）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基（北京奧博星責(zé)任股份有限公司）；過硫酸銨、冰醋酸（天津市百世化工有限公司）；TEMED、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、SDS、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-250（艾勒科技有限公司）；甲醇（天津市科銳思精細(xì)化工有限公司）；蛋白Marker（北京鼎國盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；濾紙

1.2儀器

電泳槽（北京六一儀器廠，型號DYCZ-24DN），電泳儀（北京六一儀器廠，型號DYY-6B型），搖床。

1.3方法

1.3.1大蒜素對痢疾桿菌的抑菌作用

1.3.1.1 菌懸液的制備

福氏痢疾志賀菌于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)37℃ 18-24h，用無菌生理鹽水將新鮮平板培養(yǎng)物洗下，以MH肉湯培養(yǎng)基制成濃度為1.6×106cfu/ml的菌懸液。

1.3.1.2 大蒜素液的制備

用MH肉湯培養(yǎng)基溶解大蒜素粉末，制成0.5mg/ml的大蒜素液，備用。

1.3.1.3 大蒜素藥敏紙片的制備

將濾紙剪成直徑為0.6cm的圓形紙片，121℃ 20mins高壓滅菌冷卻后，浸入上述大蒜素液中浸泡，備用[3]。

1.3.1.4 MH瓊脂培養(yǎng)基制備

將MH瓊脂培養(yǎng)基粉末加蒸餾水溶解后，121℃ 20mins高壓滅菌，冷卻至約50℃后注入120mm的玻璃培養(yǎng)皿中，待凝固后備用。

1.3.1.5 抑菌作用

取1ml上述濃度的菌懸液，涂布法均勻接種于MH瓊脂培養(yǎng)皿中，將大蒜素藥敏紙片貼于培養(yǎng)皿中心處，37℃培養(yǎng)24h后，測量抑菌圈的大小[4]。

1.3.2 測量大蒜素的最小抑菌濃度（MIC）

采用液體稀釋法，制備含不同濃度的大蒜素MH肉湯培養(yǎng)液，然后向各濃度的肉湯中加入實(shí)驗(yàn)菌懸液并混勻，于37℃培養(yǎng)24h后，觀察其是否有菌落生長，細(xì)菌不生長的最高稀釋度為大蒜素的最低殺菌濃度。

1.3.3 SDS-PAGE電泳試驗(yàn)

配制10%的聚丙烯酰胺凝膠[5]，將1.3.2中含大蒜素的菌體及空白對照與等體積上樣緩沖液混合后，經(jīng)沸水浴5mins，與10000r/min離心1min，取上清上樣，每孔30μl，進(jìn)行電泳。然后用考馬斯亮藍(lán)染色液染色3h，再脫色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 表1 大蒜素對福氏痢疾志賀菌的抑菌情況

3結(jié)論

3.1大蒜素對痢疾桿菌的抑菌作用

用K-B法初步檢測大蒜素對痢疾桿菌是否有作用，從表1中可以看出大蒜素對痢疾桿菌有一定的抑菌作用，其抑菌環(huán)直徑為15.3±1.676305mm。

3.2測量大蒜素的最小抑菌濃度（MIC）

用液體稀釋法檢測大蒜素對痢疾桿菌的最小抑菌濃度應(yīng)該為100ug/ml

3.3對最小抑菌濃度的培養(yǎng)物和沒有加藥的陰性對照進(jìn)行的SDS-PAGE可以看出在2-105kD中間有幾條蛋白條帶有缺失或者降低的情況，說明藥物可能作用于該位置上，從而干擾細(xì)菌的增殖。

4討論

目前，關(guān)于菌痢的確切發(fā)病機(jī)制尚未明確，國外學(xué)者研究認(rèn)為，痢疾桿菌的感染可能包括以下過程[6-8]：1、痢疾桿菌通過微皺褶細(xì)胞進(jìn)入結(jié)腸粘膜，Sansonetti等[9]發(fā)現(xiàn)具黏附性而無侵襲性的痢疾桿菌變異株BS15感染后，M細(xì)胞伸展似一大口袋裝，其內(nèi)含有大量的單核細(xì)胞；2、定植的巨噬細(xì)胞吞噬痢疾桿菌后發(fā)生凋亡，釋放炎癥因子，Hilbil等[10]發(fā)現(xiàn)LPS與IFN-γ可阻止痢疾桿菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，其機(jī)制不清，可能與LPS與IFN-γ激活巨噬細(xì)胞、增強(qiáng)其殺菌活性有關(guān)；3、痢疾桿菌侵襲臨近的上皮細(xì)胞，在其內(nèi)增殖、擴(kuò)散及導(dǎo)致年末損傷。

細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性是自然界的抗生現(xiàn)象，其主要通過4種方法產(chǎn)生耐藥性：1、產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶，使抗菌藥物失活或結(jié)構(gòu)改變；2、

抗菌藥物作用導(dǎo)致靶位改變或數(shù)目改變，使之不與抗菌藥物結(jié)合；3、改變細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使抗菌藥物不能進(jìn)入菌體內(nèi)；4、通過主動排外作用，將藥物排出菌體之外[11]。大蒜素是一種天然廣譜抗生素，其作用機(jī)制是抑制細(xì)胞內(nèi)巰基酶的活性，影響細(xì)菌的代謝，破壞其生長繁殖[12]。

本實(shí)驗(yàn)首先用K-B法發(fā)現(xiàn)大蒜素對痢疾桿菌有抑菌作用，然后又采用液體稀釋法檢測出大蒜素對痢疾桿菌的MIC值。初步探討了大蒜素對痢疾桿菌有抑菌作用。

自20世紀(jì)90年代首次提出“蛋白質(zhì)組”概念以來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到快速發(fā)展。“蛋白質(zhì)組”研究是對基因組研究的重要補(bǔ)充，它能在蛋白質(zhì)水平定量、動態(tài)、整體性研究生物體，是生命活動機(jī)制的分析工具。本實(shí)驗(yàn)分析了在大蒜素作用前后，痢疾桿菌蛋白質(zhì)圖譜的改變，我們初步發(fā)現(xiàn)有6-7個部位的蛋白發(fā)生了變化比較明顯，為進(jìn)一步大蒜素對痢疾桿菌的作用機(jī)制，以及痢疾桿菌致病的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

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