用RP－HPLC法測定靶控輸注下血漿中的丙泊酚濃度

夏 雨，魏 威，李 任，史麗敏，劉韶華，田 鳴

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院西藥劑科，北京100050；2.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院麻醉科，北京100050）

丙泊酚作為全身靜脈麻醉藥在臨床廣泛用于麻醉誘導及維持。靶控輸注（target－controlled infusion，TCI）是指在輸注靜脈麻醉藥時，以藥動學和藥效學原理為基礎(chǔ)，通過調(diào)節(jié)血漿藥物濃度來控制或維持適當?shù)穆樽頋舛?，以滿足臨床麻醉的一種靜脈給藥方法［1］。近年來，TCI在國內(nèi)外已逐步代替間斷注射或持續(xù)輸注，成為最具應(yīng)用前景的丙泊酚靜脈麻醉方式［2，3］。雖然TCI給藥時可顯示計算血漿濃度（calculated plasma concentration，Ccp）和效應(yīng)室濃度（effect－site concentration，Ce）等信息，作為麻醉深度的判斷指標，但是由于目前選用的參數(shù)模型多為國外大規(guī)模群體藥動學模型，與中國人的藥動學不匹配［4，5］，從而導致Ccp與實測血藥濃度（measured plasma concentration，Cmp）之間存在差異［6］。丙泊酚的藥動學特點是靶控輸注給藥方式的主要理論基礎(chǔ)，而建立一種條件適合、準確、簡便、穩(wěn)定的丙泊酚血藥濃度測定方法則是群體藥動學研究的基礎(chǔ)。目前，測定丙泊酚的血漿濃度多采用氣相色譜、HPLC法和氣－質(zhì)聯(lián)用等方法，方法復雜且未結(jié)合臨床研究條件。本研究建立了操作更為快速、簡便的RP－HPLC法檢測丙泊酚的血藥濃度，并以臨床小樣本數(shù)據(jù)對方法進行驗證，以期為丙泊酚在中國人的群體藥動學研究奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器 Agilent 1100型HPLC儀（包括真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器、惠普1100色譜工作站及自動進樣裝置（美國Agilent公司）；Shim－pack CLC ODS－C18色譜柱（150mm× 6.0mm，5μm，日本島津公司）；MS2型渦旋混合器（德國IKA公司）；2－5型離心機（德國Sigma公司）。

1.2 藥品和試劑 丙泊酚對照品（純度100.0%，1g／ml，英國AstraZeneca公司惠贈，批號L－22270－906－049）；內(nèi)標：百里酚（thymol，分析純，中國食品藥品檢定研究院，批號100508－200301）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；水為純凈水（首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院藥檢室自制）；空白血漿（首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院血液科提供）。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制 （1）內(nèi)標工作液：精密稱取百里酚25mg溶于50ml甲醇，配成濃度為0.5mg／ml的儲備液，保存于4℃冰箱備用。工作時，將該儲備液用適量甲醇溶解，稀釋成濃度為10μg／ml的內(nèi)標工作液。（2）血漿樣品溶液：精密吸取200μl自然解凍后的人血漿，置于5ml帶蓋的試管中，加入甲醇20μl，混勻，精密加入10μg／ml的內(nèi)標工作液600μl，再次混勻后，以603.7×g離心10min，取上清液即為血漿樣品溶液。（3）對照品溶液：精密吸取1ml丙泊酚對照品溶液，用甲醇稀釋到100ml，再取0.5ml稀釋到50ml，得到濃度為100.0μg／ml的對照品儲備液。精密量取該儲備液適量，用甲醇稀釋，配成系列濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg／ml的丙泊酚對照品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：Shim－pack CLC ODS－C18柱（150mm×6.0mm，5μm）；流動相：乙腈∶水＝65∶35，流速：1.5ml／min；檢測波長：220nm；柱溫：25℃：進樣量：100μl。在此色譜條件下，取空白血漿、含內(nèi)標工作液的空白血漿、含內(nèi)標工作液和丙泊酚對照品的空白血漿以及血漿樣品分別進樣測定，得到色譜圖見圖1。由圖1可見，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)和臨床可能的合并用藥不干擾主藥的測定，內(nèi)標與丙泊酚完全分離且峰形良好，丙泊酚和內(nèi)標百里酚的保留時間分別約為7.5和4.7min。

圖1 丙泊酚的HPLC譜圖Figure 1 HPLC photograms of propofol

2.3 標準曲線的制備 精密量取空白血漿180μl放入5ml帶蓋試管中，加入不同濃度的丙泊酚對照品溶液20μl，得到丙泊酚系列濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg／ml的血漿樣品，混勻，精密加入內(nèi)標工作液600μl，再次混勻，以603.7×g離心10min，，取上清液作HPLC分析。將丙泊酚與內(nèi)標的峰面積之比（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得到標準曲線方程：Y＝11.329 X－0.051 5（r＝0.999 8），線性范圍為0.05～5.0μg／ml，最低檢測濃度為0.05μg／ml（S／N≥3）。

2.4 回收率和精密度實驗 取空白血漿加入適量丙泊酚對照品儲備液，配制成低、中、高濃度分別為0.5、2.0、5.0μg／ml的血漿樣品，按2.1項下方法（2）處理，得到血漿樣品溶液。在同1d內(nèi)進樣5次，計算丙泊酚的回收率和日內(nèi)精密度；在第1、3、5天各測定1次，計算日間精密度，結(jié)果見表1。

2.5 穩(wěn)定性實驗 取2.4項下丙泊酚低、中、高濃度分別為0.5、2.0、5.0μg／ml的血漿樣品，在配置后4℃條件下保存1、15、30d，測定濃度并計算RSD。結(jié)果低、中、高濃度丙泊芬的RSD分別為3.84%、7.74%和2.73%（n＝5）。由此可見，丙泊酚血漿樣品在配置后儲存30d無明顯變化，穩(wěn)定性良好。

2.6 靶控輸注下測定丙泊酚的血漿濃度

表1 丙泊酚的回收率和精密度實驗結(jié)果Table 1 Results of recovery and precision tests of propofol（n＝5，±s，%）

表1 丙泊酚的回收率和精密度實驗結(jié)果Table 1 Results of recovery and precision tests of propofol（n＝5，±s，%）

（ρB／μg·ml－1） 日內(nèi)RSD濃度 日間RSD 回收率0.5 2.38 5.93 103.0±2.5 2.0 1.42 5.12 98.0±1.4 5.0 3.07 4.54 102.5±3.1

2.6.1 臨床資料和麻醉方案 選擇5例行全身麻醉的病人，男性3例，女性2例，年齡32～71歲，均符合美國麻醉醫(yī)師協(xié)會病情估計分級I～III級，無全身麻醉禁忌，手術(shù)時間2～4h，無明確的精神疾病、藥物濫用及酗酒史，術(shù)中無大出血。所有病人均通過肘正中靜脈在30min內(nèi)輸入乳酸鈉林格液，劑量為10ml／kg，之后采用“Diprifusor”TCI系統(tǒng)（由英國AstraZeneca公司“得普利麻”預充注射器、Diprifusor識別軟件、靶控輸注軟件，以及英國Grasby公司3500注射泵組成），選擇內(nèi)置的TCI模式，輸入病人的年齡和體重，以靶控血漿濃度（target－controlled plasma concentration，Ctp）3.5μg／ml輸注丙泊酚，同時以Ctp 4.0ng／ml輸注瑞芬太尼，給予羅庫溴銨，劑量為0.9mg／kg，2min后行氣管內(nèi)插管，待丙泊酚Ccp達到3.5μg／ml并持續(xù)30min后，將Ctp下調(diào)為3.0μg／ml，間斷給予羅庫溴銨維持肌松。待丙泊酚Ccp達到3.0μg／ml并持續(xù)30min后，再將Ctp下調(diào)為2.5μg／ml。手術(shù)結(jié)束前停用丙泊酚和瑞芬太尼，靜脈給予芬太尼0.1mg。

2.6.2 血樣采集 在丙泊酚Ccp分別達到3.5、3.0、2.5μg／ml并持續(xù)30min時，抽取橈動脈血各3ml，注入含肝素的試管內(nèi)，以603.7×g離心10min，分離血漿，保存于4℃冰箱備用。測定時，將血漿按2.1項下方法（2）操作，制備血漿樣品溶液，測定丙泊酚的濃度，結(jié)果5例病人在上述3個時間點的血藥濃度平均值分別為（3.48±0.19）、（2.99±0.12）和（2.48±0.17）μg／ml，與靶控輸注泵上顯示的Ccp比較，相對標準偏差分別為5.49%、3.96%和6.97%。

3 討 論

丙泊酚的化學結(jié)構(gòu)中具有苯酚母核，有較強的紫外吸收和熒光吸收。本研究的HPLC法采用紫外檢測器，雖然靈敏度較熒光檢測器低，但最低檢測限低至0.05μg／ml。對于臨床麻醉監(jiān)測，TCI麻醉誘導期丙泊酚的血漿濃度在3min左右就達到3.5μg／ml，麻醉誘導及蘇醒期血藥濃度大多維持在1～5μg／ml，因此紫外檢測法可以滿足測定要求。

本研究采用沉淀法進行血漿樣品處理，比萃取法更簡單、快速，適用于臨床大樣本血藥濃度監(jiān)測。在沉淀劑的選擇上，經(jīng)過對比實驗，發(fā)現(xiàn)用乙腈時在內(nèi)標峰處有雜質(zhì)峰干擾，而用3倍體積的甲醇沉淀血漿蛋白質(zhì)完全，無需添加三氯乙酸或硫酸銨等蛋白質(zhì)沉淀劑，亦無干擾峰出現(xiàn)，因此采用在血樣中直接加入內(nèi)標物的甲醇溶液來沉淀蛋白質(zhì)，再次簡化了預處理過程。本研究僅用乙腈和水組成流動相，即可得到良好的色譜峰峰形和合適的出峰時間，流動相體系簡單，易于重復。本研究考察了血漿中的其他藥物成分，即5例病人手術(shù)前與手術(shù)中與丙泊酚合并使用的藥物，如苯巴比妥、多巴胺、瑞芬太尼、羅庫溴銨、利多卡因、腎上腺素、甘露醇、地塞米松、肝素鈉和魚精蛋白等對主藥峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其他藥物并不干擾內(nèi)標和丙泊酚的測定，不會造成主藥不出峰或出峰時間延遲，表明該法專屬性較好，可以用于靶控輸注下丙泊酚血漿濃度的測定。

采用靶控輸注丙泊酚，在其Ccp達到Ctp時再繼續(xù)平衡30min，此時丙泊酚的血漿濃度已達到相對穩(wěn)態(tài)，個體間藥動學差異被降至最小，采集血樣并測定Cmp，與靶控輸注泵上顯示的Ccp進行比較，差距為3.96%～6.97%，表明本法可以準確測量丙泊酚的血漿藥物濃度。本方法簡便、快速、準確、重現(xiàn)性好，可以滿足丙泊酚臨床藥動學研究的需要。

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