硒酸酯多糖對人食管鱗癌Eca109細(xì)胞增殖及凋亡的影響

岳黎敏,楊以會(huì),趙克勝

(1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河北邯鄲 056029;2.河北省邯鄲礦業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院麻醉科 056003)

硒酸酯多糖對人食管鱗癌Eca109細(xì)胞增殖及凋亡的影響

岳黎敏1,楊以會(huì)1,趙克勝2

(1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河北邯鄲 056029;2.河北省邯鄲礦業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院麻醉科 056003)

目的研究硒酸酯多糖(KSC)對人食管鱗癌Eca109細(xì)胞增殖及凋亡的影響,并初步探討其作用機(jī)制?方法 甲基噻唑基四唑(MTT)法檢測不同濃度KSC對Eca109細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)觀察KSC對Eca109細(xì)胞凋亡的影響;Western blot技術(shù)檢測KSC對Eca109細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)蛋白表達(dá)水平的影響?結(jié)果KSC可明顯抑制Eca109的增殖(P0.05),并呈時(shí)間及濃度依賴性;經(jīng)KSC作用后,Eca109細(xì)胞的凋亡率隨KSC作用時(shí)間的延長(24?48?72h)及KSC濃度的增加(30?60?120μg/mL)而明顯升高(P0.01);KSC(60?120μg/mL)顯著下調(diào)Eca109細(xì)胞核中 NF-κB蛋白水平(P0.01)?結(jié)論

KSC對Eca109細(xì)胞具有抑制增殖?誘導(dǎo)凋亡作用,其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)?

食管腫瘤;細(xì)胞凋亡;NF-κB;硒酸酯多糖

硒酸酯多糖(kappa-selenocarrageenan,KSC)是一種新型的有機(jī)硒化合物,是微量元素硒與天然產(chǎn)物κ-卡拉膠半合成的一種含硒的生物活性多糖,又稱硒化卡拉膠?研究表明KSC對人肝癌?乳腺癌?骨肉瘤等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用[1-3],然而其對食管癌細(xì)胞株的增殖及凋亡的影響尚未見報(bào)道?本研究旨在探討KSC對食管鱗癌Eca109細(xì)胞株增殖?凋亡的影響及其可能機(jī)制?

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 人食管鱗癌Eca109細(xì)胞株由本室保存?主要試劑包括硒酸酯多糖(上海天賜福生物工程有限公司,含硒量1.68%)?RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco BRL)?碘化丙啶(propidium iodide,PI)(Sigma)?甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(Sigma)?細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(Pierce公司)?兔抗人核因子(nuclear factor,NF)-κB?β-actin單克隆抗體和羊抗兔第二抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)?

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管鱗癌Eca109細(xì)胞株在含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)?100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,于37℃5%CO2條件下培養(yǎng)?

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測KSC對Eca109增殖的影響 取對數(shù)生長期Eca109細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為1×105/mL),加樣每孔100μL于96孔培養(yǎng)板中?實(shí)驗(yàn)組加入等體積不同濃度KSC(終濃度分別為30?60?120μg/mL),陰性對照組加入等體積溶劑?各設(shè)4個(gè)復(fù)孔?置37℃?飽和濕度?5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?48?72h后,各孔加入 MTT(5g/L)20μL孵育4h,棄上清液,每孔加入二甲基亞砜150μL,振蕩10min,待結(jié)晶溶解后,用酶標(biāo)儀于570nm波長處測定光密度(optical density,OD)值?并按下式公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率(inhibition ratio,IR)?IR(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均 OD值/對照組平均OD值)×100%?

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 收集陰性對照組和經(jīng)30?60?120μg/mL KSC作用24?48?72h后的Eca109細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次?加入70%冷乙醇固定12h,離心去乙醇,37℃RNA酶處理1h,與PI室溫反應(yīng)10min,流式細(xì)胞術(shù)測定凋亡率?每個(gè)濃度重復(fù)3次?

1.2.3 Western blot測定NF-κB蛋白的表達(dá) KSC處理48h后,收集對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,以0.01mol/L PBS洗2次,懸浮在0.4mL裂解液中,冰浴10min,14 800g離心30s,棄上清液,收集細(xì)胞核沉淀,懸浮在100μL冰冷核蛋白提取液中,冰浴20min,并不斷震蕩,14 800g離心30s,收集上清液,即為細(xì)胞核蛋白,用Lowery法進(jìn)行定量?加等量蛋白于上樣緩沖液,煮沸,在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離,電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上?5%脫脂奶粉封閉2h后,加兔抗人NF-κB單抗和β-actin一抗孵育,4℃過夜?加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗,37 ℃孵育1h,3,3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色?對免疫印跡條帶進(jìn)行分析掃描,結(jié)果以測定蛋白條帶與β-actin的積分吸光度(integrated optical density,IOD)比值表示NF-κB蛋白的相對表達(dá)水平?每個(gè)濃度均重復(fù)3次?

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果用±s表示,采用t檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 KSC對Eca109增殖的抑制作用 KSC處理組Eca109細(xì)胞的增殖均受到不同程度的抑制,并呈明顯時(shí)間和濃度依賴性(圖1),IR最高達(dá)87.3%,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P0.05)?

圖1 腫瘤細(xì)胞生長抑制率與硒酸酯多糖不同作用濃度及時(shí)間的關(guān)系(n=4)

2.2 KSC對Eca109細(xì)胞凋亡的影響 KSC處理組在作用24?48?72h后,Eca109細(xì)胞的凋亡率隨藥物作用時(shí)間的延長和藥物濃度的增加而明顯升高(P0.01),見圖2?

圖2 硒酸酯多糖對Eca109細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

圖3 硒酸酯多糖對細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

2.3 KSC對Eca109細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)不同濃度(30?60?120μg/mL)KSC處理48h后,Eca109細(xì)胞 NF-κB蛋白表達(dá)水平的校正值(NF-κB/β-actin)分別為0.734±0.190?0.323±0.060和0.196±0.070?隨KSC濃度增加,NF-κB蛋白表達(dá)水平逐漸降低?60?120 μg/mL處理組顯著低于對照組(0.873±0.040)(P0.01),見圖3?

3 討 論

硒是人體一種必需微量元素,流行病學(xué)及臨床資料顯示微量元素硒與食管鱗癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)性?高濃度的亞硒酸鈉?硒蛋氨酸對食管癌細(xì)胞均具有抑制生長?誘導(dǎo)凋亡的作用[4-5]?國內(nèi)外相關(guān)研究顯示,不同硒化合物對各類腫瘤細(xì)胞的影響不同[6]?KSC是一種新型的有機(jī)硒化合物,與無機(jī)硒相比,KSC具有生物活性高?毒性小?生物利用度高等特點(diǎn)?已有研究顯示,KSC對肝癌?乳腺癌?卵巢癌及骨肉瘤等多種癌細(xì)胞具有抑制生長?誘導(dǎo)凋亡的作用[7]?本研究顯示藥理劑量的KSC可顯著抑制Eca109細(xì)胞增殖,且隨藥物濃度增加及作用時(shí)間延長,其抑制作用增強(qiáng);藥理劑量的KSC作用下,Eca109細(xì)胞凋亡率顯著增加,并也呈明顯時(shí)間和濃度依賴性?

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB最常見的形式是P50/P65異源二聚體?NF-κB常與其抑制物IκBs蛋白結(jié)合,以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中?多種活化因子可通過磷酸化IκBs,釋放NF-κB,激活的NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,從而調(diào)節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄?NF-κB信號(hào)通路參與了感染?細(xì)胞凋亡和腫瘤等病理過程?NF-κB可誘導(dǎo)許多抗凋亡基因,包括凋亡抑制因子?Bcl-2?腫瘤壞死因子受體結(jié)合因子1和2等[8]?研究發(fā)現(xiàn),多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)均存在著異常激活的NF-κB,并且可能是腫瘤細(xì)胞抗凋亡的主要途徑之一[9-10]?已有研究發(fā)現(xiàn),亞硒酸鈉可通過抑制 NF-κB信號(hào)通路影響前列腺癌細(xì)胞的生長及凋亡[11],在食管鱗癌組織中存在 NF-κB表達(dá)的顯著升高[12-13]?為探討 KSC的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)檢測了KSC對NF-κB表達(dá)的影響,結(jié)果顯示高濃度的KSC可顯著減少進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白含量,提示KSC對Eca109細(xì)胞的作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)?

NF-κB信號(hào)通路作為腫瘤防治的新靶點(diǎn)日益受到關(guān)注,采用天然或人工合成的NF-κB抑制物,抑制該信號(hào)通路對多種腫瘤的臨床防治具有重要意義[14-15]?KSC作為NF-κB信號(hào)通路的抑制物,在臨床食管鱗癌防治中具有廣闊的應(yīng)用前景?

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Effect of kappa-selenocarrageenan on proliferation and apoptosis in human esophageal squamous carcinoma Eca109 cell line

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(1.,, 056029,;2.,, 056003,.)

ObjectiveTo study the effect of kappa-selenocarrageenan(KSC)on the proliferation and apoptosis of esophageal squamous carcinoma cell line Eca109and its mechanism.MethodsAfter treatment with KSC at different concentrations,the inhibitory effect on proliferation of Eca109cells was measured by MTT and the apoptotic rates were analyzed with flow cytometry.Abundance of NF-κB protein of Eca109cells was detected by Western-blot.ResultsKSC could inhibit the growth of Eca109cells in both dose and time dependent manners(P0.05).The apoptotic rate of Eca109cells was significantly increased by KSC in a time-dependent(24,48and 72h)and concentration-dependent(30,60,120μg/mL)manners(P0.01).Abundance of NF-κB protein was down regulated in KSC(60,120μg/mL)treated Eca109cells(P0.01).ConclusionKSC can inhibit the proliferation and induce apoptosis of Eca109cells,which is correlated with down-regulation of the abundance of NF-κB protein.

esophageal neoplasms;apoptosis;NF-kappa B;kappa-selenocarrageenan

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.019

A

1671-8348(2012)16-1612-02

2011-10-11

2011-12-26)

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