肺炎鏈球菌蛋白疫苗候選蛋白研究進(jìn)展

李莉莉 鄭 凡 王 健 (北京生物制品研究所，北京100024)

肺炎鏈球菌能夠引起肺炎、腦膜炎、中耳炎等疾病，在世界范圍內(nèi)具有很高的致病率和致死率?；颊咧饕性趮胗變?、老年人和免疫力低下的人群。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年大約有一百萬(wàn)的五歲以下兒童死于肺炎鏈球菌引起的疾?。?］?？股厥欠窝祖溓蚓鸺膊∽畛Ｓ玫闹委熕幬铮?，耐青霉素和多重耐藥菌的出現(xiàn)使這些疾病的治療難度大大增加，同時(shí)，治療費(fèi)用也逐步攀升［2］，而疫苗是解決這個(gè)問(wèn)題的最好方法。

莢膜多糖是最早被認(rèn)識(shí)的肺炎鏈球菌致病因子，擁有80種以上血清型。1983年，美國(guó)批準(zhǔn)使用23價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗(23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine，PPV23)，該多糖疫苗對(duì)相對(duì)應(yīng)的血清型(如1、2、3、4、5、6B、7N、8、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F)預(yù)防效果大于65%，但對(duì)此23個(gè)型別以外的其他型別的有效率為0%～60%。而攜帶和發(fā)病率最高的小于2歲的兒童和免疫受損害者對(duì)該疫苗的抗體應(yīng)答較弱甚至無(wú)效［3］。7價(jià)結(jié)合肺炎鏈球菌疫苗(Heptavalent pneumococcal conjugate vaccine，PCV7)于2000年在美國(guó)上市，該疫苗是針對(duì)肺炎鏈球菌7個(gè)血清型(4，6B，9V，14，18C，19 F，23 F)的莢膜多糖，能夠100%的預(yù)防其所包含的7個(gè)血清型細(xì)菌的感染。與23價(jià)苗的不同是，7價(jià)結(jié)合苗能夠引起T細(xì)胞免疫，能夠?qū)π∮?歲的嬰幼兒有100%的作用，對(duì)于預(yù)防疫苗型菌株引起的侵襲性疾病有效率為97．4%。但因?yàn)閮H包括7個(gè)血清型，該疫苗的應(yīng)用在美國(guó)致使非疫苗型細(xì)菌所致侵襲性疾病的發(fā)病率升高了25%［4］。目前，國(guó)內(nèi)13價(jià)結(jié)合苗也在研制中，但是這種結(jié)合苗質(zhì)量難于控制，成本也大大增加。由于過(guò)于昂貴，所以一些經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的結(jié)合苗被放棄使用。這就要求研發(fā)更加有效且便宜的疫苗，而蛋白疫苗就是解決這個(gè)問(wèn)題的最好途徑。蛋白疫苗有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì):(1)保護(hù)作用范圍廣，可以對(duì)所有年齡和免疫狀態(tài)的人群產(chǎn)生保護(hù)作用，并且誘發(fā)免疫記憶，保護(hù)力持久。(2)采用高度保守的共同蛋白作為疫苗，不受血清型限制，對(duì)于所有血清型均產(chǎn)生效果。(3)價(jià)格相對(duì)低廉，生產(chǎn)成本低，適合發(fā)展中國(guó)家大規(guī)模的使用。本文對(duì)最有希望成為候選疫苗的蛋白進(jìn)行綜述。

1 溶血素(Pneumolysin，Ply)

Ply是一個(gè)由471個(gè)氨基酸組成的分子量為53 kD蛋白，定位于肺炎鏈球菌的細(xì)胞漿，在細(xì)胞生長(zhǎng)到某個(gè)階段時(shí)被釋放出來(lái)。Ply的主要作用是溶血和激活補(bǔ)體。Ply可能存在四個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為domain1-4，其主要活性位點(diǎn)存在于domain4。Ply與受體結(jié)合并插入到細(xì)胞膜，啟動(dòng)溶血功能(主要定位在domain4 C末端)。而激活補(bǔ)體的區(qū)域主要定位于domain4 N末端［5］。Ply能夠破壞蜂窩狀連接細(xì)胞，阻止呼吸上皮和室管膜的纖毛蠕動(dòng);降低多型核白細(xì)胞的遷移和吞噬活性，能刺激宿主細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子［6］。通過(guò)與IgG的Fc段結(jié)合可直接激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，同時(shí)促進(jìn)炎癥反應(yīng)和消除血清的調(diào)理作用。

鼻腔和腹膜腔的肺炎鏈球菌攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組Ply可使老鼠壽命延長(zhǎng)89%和93%。在肺炎鏈球菌動(dòng)脈注射的攻擊實(shí)驗(yàn)中，Ply不能徹底保護(hù)老鼠。鼻內(nèi)洗滌法也不能減低鼻內(nèi)致病菌的數(shù)量。但是鼻內(nèi)攻擊實(shí)驗(yàn)中能夠降低肺內(nèi)的致病菌數(shù)。這些結(jié)果顯示，Ply對(duì)于細(xì)菌在鼻咽的復(fù)制沒(méi)有作用，但是對(duì)于病菌在肺部的復(fù)制、并且穿越肺部進(jìn)入血液，最后在血液中高滴度復(fù)制具有重要作用［7］。

Ply的全氨基酸序列高度保守，抗原性強(qiáng)。因此，Ply可以作為覆蓋所有血清型抗原疫苗的備選蛋白［8］，而且該疫苗潛能已經(jīng)被不同實(shí)驗(yàn)室證實(shí)。盡管免疫制備方法不同、所用肺炎鏈球菌的血清型不同、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)不同，但是，Ply的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)得到了一致的結(jié)果。

2 肺炎鏈球菌表面粘附素A(Pneumococcal surgace antigen，PsaA)

PsaA是一個(gè)35 kD、由309個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)［9］。PsaA在肺炎鏈球菌粘附、自溶以及毒力方面都起著重要作用。PsaA與多種菌體粘附素的氨基酸序列高度同源。X晶體衍射實(shí)驗(yàn)顯示，PsaA是一個(gè)橢圓形蛋白［10］，模體分析結(jié)果確認(rèn)，PsaA是一種脂蛋白，它的N末端共價(jià)結(jié)合在細(xì)胞膜的磷脂層上。因?yàn)榧?xì)胞壁的厚度和蛋白大小的關(guān)系，PsaA被埋在多聚糖和莢膜多糖下面，所以，抗PsaA抗體無(wú)法結(jié)合到細(xì)胞壁上［11］。

PsaA在各個(gè)血清型中都是高度保守，沒(méi)有大的抗原和分子變化。PsaA已經(jīng)被作為疫苗在患有鼻炎、肺炎、菌血癥和敗血癥的動(dòng)物模型中進(jìn)行了評(píng)價(jià)。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果顯示，PsaA免疫效果在鼻咽部分的作用效果明顯，但在不同血清型之間存在差異，如對(duì)于WU2型，PsaA有良好保護(hù)性，但對(duì)A66．1作用就不明顯［12］。PsaA對(duì)所有D39(3血清型)攻擊的小鼠都能延長(zhǎng)壽命，但對(duì)WCH43(4血清型)沒(méi)有作用，推測(cè)可能在不同型別菌體的細(xì)胞壁厚度、莢膜多糖等因素決定了PsaA暴露程度不同，從而導(dǎo)致免疫效果有差異，所以，PsaA可以作為肺炎鏈球菌蛋白疫苗的重要組成部分。

3 肺炎鏈球菌表面蛋白A(Pneumococcal surfaceprotein A，PspA)

PspA是肺炎鏈球菌細(xì)胞表面的膽堿結(jié)合蛋白，也是一種重要致病因子。它的主要作用是與乳鐵蛋白結(jié)合使乳鐵蛋白喪失功能，從而失去乳鐵蛋白對(duì)菌體生長(zhǎng)的控制［13］;抑制補(bǔ)體活化，降低C3b在肺炎鏈球菌表面的沉積，從而干擾補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬調(diào)理作用［14］。PspA與PsaA和PLY不同的是，在不同型別間，PspA核酸和氨基酸序列并不保守。抗體免疫可以發(fā)生交叉反應(yīng)，但并不是對(duì)每個(gè)血清型都有效。這種變化與菌體上莢膜多糖的血清型并不相關(guān)。盡管不同PspA的序列不同，但都有相似的空間結(jié)構(gòu)。PspA有四個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域:N末端的α螺旋、脯氨酸富集區(qū)、高度保守的20個(gè)氨基酸重復(fù)序列和在C末端輕度疏水的17個(gè)氨基酸序列［15］。根據(jù)細(xì)胞表面α螺旋區(qū)的不同，將PspA分成6個(gè)分支3個(gè)家族。家族1和2的α螺旋區(qū)有54%同源性，其他區(qū)域有84% ～100%同源性。研究顯示，在美國(guó)、哥倫比亞、巴西、阿根廷大概有94% ～99%都是1和2家族。

在皮下和腹膜攻擊的敗血癥動(dòng)物模型中，全長(zhǎng)PspA1蛋白使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活時(shí)間和存活率分別增加了80．6%和62．5%。用PspA氮末端α螺旋區(qū)免疫以皮下攻擊的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可以延長(zhǎng)動(dòng)物的存活時(shí)間，對(duì)于同一家族的作用達(dá)50%，不同家族的作用為25%。保護(hù)作用的效力隨使用的片段的長(zhǎng)度的增加而加強(qiáng)。與PsaA和PLY相比，PspA在鼻內(nèi)定植、肺炎、敗血癥有更廣泛的保護(hù)作用。但是，PspA對(duì)膽堿有強(qiáng)烈干擾，而膽堿是細(xì)胞結(jié)構(gòu)中重要的信號(hào)，而且這種干擾作用對(duì)于人或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的負(fù)面作用還沒(méi)有得到驗(yàn)證。

4 膽堿結(jié)合蛋白A(Choline binding protein A，CbpA)

CbpA是一個(gè)多型蛋白，分子量在69 kD到120 kD之間，具有與PspA高度同源的膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域。CbpA的基因突變會(huì)導(dǎo)致肺炎鏈球菌與上皮細(xì)胞結(jié)合能力降低，也能導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼻咽部定植能力降低。提示CbpA有可能是主要負(fù)責(zé)肺炎鏈球菌與真核生物細(xì)胞粘附的作用［16］。CbpA還可以和補(bǔ)體C3以及人血清因子H結(jié)合。H因子是補(bǔ)體激活旁路途徑的調(diào)節(jié)因子，可與C3結(jié)合加快C3降解。所以，CbpA能夠幫助細(xì)菌免于補(bǔ)體旁路途徑的攻擊［17］。由此可見(jiàn)，CbpA是一個(gè)多功能蛋白，在肺炎鏈球菌粘附、入侵和逃避機(jī)體補(bǔ)體系統(tǒng)進(jìn)攻過(guò)程中起主要作用。

CbpA序列主要有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括位于N端的多形態(tài)α螺旋區(qū)、保守的脯氨酸富集區(qū)、細(xì)胞壁錨定區(qū)。盡管CbpA在肺炎鏈球菌中有很重要的作用，但是對(duì)于其免疫保護(hù)作用的研究很有限。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用CbpA的N端免疫動(dòng)物能夠大大提高腹腔或者靜脈攻擊動(dòng)物的存活率［18］。由于肺炎鏈球菌致病機(jī)理復(fù)雜，CbpA有很大作為疫苗抗原的前景，但需要更多實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。然而，由于它可與C3、H因子、pIgR分子相互作用，這些可能會(huì)影響PspC作為疫苗的安全性。

5 肺炎鏈球菌三組氨酸蛋白(Pneumococcal histidine tried proteins，Pht)

Pht是一個(gè)裸露在菌體表面的蛋白家族［19］，分子量77～88 kD，都含有一個(gè)具有三個(gè)組氨酸的模體:HXXHXH。PhtA是在利用計(jì)算機(jī)對(duì)肺炎鏈球菌全基因序列搜索帶有信號(hào)肽Ⅱ的蛋白時(shí)被發(fā)現(xiàn)的［20］，家族成員包括 PhtB、PhtD、PhtE 和 PhtA。Pht A、Pht B和PhtD同源性較高，在前三分之二的序列中有59%～81%同源性。Pht E相差較遠(yuǎn)，有40%同源性。但三組氨酸模體在蛋白理化性質(zhì)、生物學(xué)活性中的作用還沒(méi)有被確定。在這類(lèi)蛋白中，Pht B被研究得比較透徹，已證實(shí)在研究過(guò)的14個(gè)肺炎鏈球菌血清型中都有表達(dá)。在皮下和鼻內(nèi)攻擊肺炎鏈球菌的動(dòng)物模型中，Pht B能夠起到保護(hù)作用，并且可顯著降低鼻咽、肺部感染和菌血癥的風(fēng)險(xiǎn)。Pht E的免疫作用與Pht B相似，有免疫作用的位點(diǎn)均位于蛋白的C末端，PhtA、PhtD刺激產(chǎn)生保護(hù)性抗體，在致死性實(shí)驗(yàn)中保護(hù)作用為40%和80%。PhtB、PhtD、PhtE也可以作為候選疫苗蛋白，這些蛋白質(zhì)的性質(zhì)、生化功能、傳播路徑等還需要進(jìn)一步研究。

6 肺炎鏈球菌保護(hù)蛋白A(Pneumococal protective protein A，PppA)

PppA是肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白中分子量最小的蛋白，分子量20 kD。這種蛋白在用磷酸鹽緩沖液清洗完整菌體時(shí)可以大量獲得［21］。免疫電子顯微鏡觀察可見(jiàn)，抗PppA血清可以與菌體表面結(jié)合，說(shuō)明PppA是一種表達(dá)在菌體表面的蛋白。序列分析顯示，PppA蛋白不是大的開(kāi)放閱讀框的一部分，也沒(méi)有典型的分泌用信號(hào)肽序列。這種蛋白如何穿越膜的機(jī)制還不很清楚。該蛋白抗原性保守，序列也高度保守，在實(shí)驗(yàn)的各個(gè)型別中同源性達(dá)92%～97%。PppA的生化功能和在傳播中的作用等都還未知。PppA的免疫作用研究也很少，在鼻咽定植的動(dòng)物模型中產(chǎn)生了高滴度血清抗體，降低了攻擊風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于PppA仍需要進(jìn)一步研究。

7 神經(jīng)氨酸苷酶(Neuraminidase)

Neuraminidase是一種酶，能夠把粘液素、糖蛋白、糖脂類(lèi)的N-乙酰神經(jīng)氨酸末端從菌體表面切開(kāi)。生化研究顯示，肺炎鏈球菌至少有兩種神經(jīng)氨酸酶:NanA和NanB，分子量分別是100 kD和75 kD［22］。兩個(gè)蛋白的氨基酸序列并不一致。目前對(duì)NanA研究相對(duì)較多。根據(jù)序列預(yù)測(cè)分析，NanA可能有三個(gè)結(jié)構(gòu):氨基端區(qū)域、脯氨酸富集區(qū)和細(xì)胞壁錨定區(qū)。這種結(jié)構(gòu)顯示，蛋白可能是共價(jià)結(jié)合在肽聚糖的羧基上，通過(guò)跨膜區(qū)穿越細(xì)胞壁，暴露它的氨基端在菌體外。NanA的發(fā)病機(jī)制在南美粟鼠耳炎動(dòng)物模型中得到了驗(yàn)證。如果使NanA突變失活，可以輕易減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼻咽部的肺炎鏈球菌菌體。證實(shí)NanA的作用就是在肺炎鏈球菌入侵時(shí)去除上皮細(xì)胞表面的硅酸位點(diǎn)，使下面的受體暴露，增強(qiáng)菌體在鼻咽部的定植能力［23］。最新研究顯示，在不同型別間，NanA的氨基酸序列和抗原性存在較大變異，這種變化可能影響其成為疫苗的備選蛋白。

8 自溶素(Autolysin)

肺炎鏈球菌自溶素是一種酶，叫N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶(LytA)。LytA能夠降解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖骨架，能夠參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂。這種自溶素的功能在所有肺炎鏈球菌中均有顯示。LytA分子約36 kD，含兩個(gè)功能區(qū)，氨基端負(fù)責(zé)催化功能，羧基端有膽堿結(jié)合區(qū)域，使蛋白能夠和細(xì)胞壁結(jié)合［24］。電子顯微鏡觀察證實(shí)，LytA也是細(xì)胞外表面蛋白，抗LytA抗體可與肺炎鏈球菌結(jié)合。LytA序列在各個(gè)型別中都是高度保守［25］。有關(guān)LytA的免疫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的也很有限。用純化的LytA免疫鼻腔攻擊肺炎鏈球菌的小鼠，只能小幅度提高存活時(shí)間，不能提高存活率。但是，用腹腔內(nèi)注射法LytA免疫攻毒的小鼠卻能夠提高存活率。目前，雖然對(duì)這種蛋白的基礎(chǔ)研究還很少，由于LytA蛋白序列在各個(gè)性別間高度保守，使之成為了蛋白疫苗的候選目標(biāo)。

9 鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Iron transport protein，PiuA and PiaA)

鐵離子在細(xì)菌的致病過(guò)程中有重要作用，但是，肺炎鏈球菌本身并不產(chǎn)生交換鐵的含鐵細(xì)胞。研究與肺炎鏈球菌同源的革蘭氏陰陽(yáng)菌的基因時(shí)發(fā)現(xiàn)了ABC三種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的操縱子:Piu、pia、pit，每個(gè)操作子分別編碼結(jié)合蛋白、透酶、ATP酶。PiuA被研究的比較透徹，它是一種脂蛋白，處在膜外緣，可以結(jié)合血紅素和亞血紅素。但是最近研究顯示，高滴度兔抗PiuA和PiaA抗體可以在表面結(jié)合，提示這兩種蛋白可能存在于細(xì)胞的表面。PiuA和PiaA存在于所有23種型別的菌體中。目前，對(duì)于這兩種蛋白作為備選疫苗的研究十分有限［26］。

10 三種新表面蛋白

典型的疫苗抗原是分泌蛋白和表面蛋白。對(duì)肺炎鏈球菌N4基因進(jìn)行全基因序列搜索，以尋找這類(lèi)蛋白，在2 687個(gè)潛在開(kāi)放閱讀框中，發(fā)現(xiàn)了110個(gè)基因帶有一個(gè)或者多個(gè)不同模體的表面蛋白，其中108個(gè)片段包括97個(gè)完整的基因被克隆出來(lái)。相應(yīng)蛋白也被表達(dá)或純化，并進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。其中，6蛋白對(duì)通過(guò)腹腔注射攻擊的小鼠產(chǎn)生保護(hù)性作用。包括 endo-β-N-acetylglucosaminidase(LytB，SP46)，1，4-β-N-acetylmuraminidase(LytC，Sp91)和細(xì)胞壁相關(guān)絲氨酸蛋白酶(Sp128，Sp130)。這些蛋白在23個(gè)型別的菌體中無(wú)論是序列還是抗原性均保守，并且均可以發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，它們可能是好的疫苗備選蛋白，但是還需要做更進(jìn)一步的研究［27］。

11 總結(jié)

21價(jià)莢膜多糖疫苗和7價(jià)結(jié)合疫苗已具有良好保護(hù)老人和孩子免受大部分肺炎鏈球菌攻擊的作用，但是由于型別的限制以及可能發(fā)生的致病菌株替換，都要求研制新的、保護(hù)力更強(qiáng)更廣的蛋白疫苗。由于肺炎鏈球菌致病機(jī)理并不是簡(jiǎn)單的細(xì)胞毒素和細(xì)胞溶解，而是極其復(fù)雜。從最初鼻咽部的定植到入侵、到發(fā)展出癥狀，如中耳炎、腦膜炎、肺炎、菌血癥等，肺炎鏈球菌都是用不同的毒力因子，在不同的階段感染和破壞機(jī)體組織，同時(shí)逃避機(jī)體的免疫機(jī)制。這些不同的蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體有不同的保護(hù)作用。在所研究的蛋白中，PsaA、PspA、PhtB、PppA、NanA能夠有效清除50%以上鼻內(nèi)感染。PspA、PhtB蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)作用的抗體，是好的疫苗備選蛋白。幾種蛋白的聯(lián)合應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生更加強(qiáng)大和復(fù)雜的保護(hù)作用，如PsaA、Ply、PspA的聯(lián)合使用可以在動(dòng)物模型中產(chǎn)生更加強(qiáng)大的保護(hù)作用。如果這些蛋白不能作為疫苗提供有效的保護(hù)，它還可以作為一種蛋白載體服務(wù)于多糖疫苗，或者作為現(xiàn)在一些疫苗的補(bǔ)充成分，為疫苗中所不能提供保護(hù)的型別提供保護(hù)。制備蛋白疫苗相對(duì)簡(jiǎn)單、廉價(jià)，又具有保護(hù)作用強(qiáng)、保護(hù)范圍廣等多糖疫苗所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，所以，蛋白質(zhì)疫苗取代多糖和多糖結(jié)合疫苗是發(fā)展的趨勢(shì)。

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