非小細(xì)胞肺癌VEGF-C的表達(dá)及LYVE-1標(biāo)記的微血管密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

劉東華 (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院保健中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的首位，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者無法手術(shù)徹底切除和預(yù)后差的最重要原因之一，但其發(fā)生機(jī)制仍不清楚。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-C)是與腫瘤淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要因子。研究表明，腫瘤患者表達(dá)的VEGF-C與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究旨在探討NSCLC患者VEGF-C蛋白的表達(dá)及內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體(LYVE-1)標(biāo)記的微血管密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年6月至2009年12月本院手術(shù)治療的56例NSCLC組織作為研究對象，所有患者均經(jīng)過病理學(xué)檢測，手術(shù)前均沒有進(jìn)行化療或者放射性治療。56例NSCLC患者中男39例，女17例，年齡36～74〔平均(56.25±10.48)〕歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟制訂的NSCLC TNM 分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期4例，Ⅲ期21例(包括Ⅲa期18例以及Ⅲb期3例)，Ⅳ期為2例。病理類型:鱗癌24例，腺癌29例，大細(xì)胞癌3例。所有患者進(jìn)行淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分析，其中43例有轉(zhuǎn)移，13例未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。對照組10例均為肺良性病變，男7例，女3例;年齡32～75〔平均(51.13±8.26)〕歲;肺大皰3例，肺錯構(gòu)瘤2例，肺外傷6例。

1.2 免疫組化染色 所有患者的病變組織首先進(jìn)行石蠟包埋，然后進(jìn)行5 μm連續(xù)切片，再行HE以及免疫組織化學(xué)染色。VEGF-C單克隆抗體以及LYVE-1單克隆抗體(羊抗人)均購自美國R＆D，VEGF-C、LYVE-1表達(dá)水平的分析采用免疫組化試劑盒(購自北京中杉公司)。LYVE-1和VEGF-C石蠟切片分別采用檸檬酸緩沖液以及EDTA緩沖液進(jìn)行高溫修復(fù)。最后用DAB顯色，蘇木精進(jìn)行復(fù)染。

1.3 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)染色分析VEGF-C蛋白應(yīng)位于腫瘤細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。結(jié)果判定按Mattern法〔1〕:根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占面積積分之和來判斷。染色強(qiáng)度積分:不染色=0;輕度染色(淡黃色)=1;中度染色(黃色)=2;強(qiáng)染色(棕黃色或黃褐色)=3。染色面積積分:無細(xì)胞染色=0;＜25%細(xì)胞染色=1;25% ～50%細(xì)胞染色=2;＞50%細(xì)胞染色=3。兩種積分之和≥3分者為表達(dá)陽性;≤2表達(dá)陰性。LYVE-1蛋白主要存在于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。LMVD計數(shù)根據(jù)Wendner的方法進(jìn)行〔2〕，即:先在低倍鏡下對整個切片進(jìn)行分析，尋找血管最為密集處，然后再在高倍鏡下對染色的淋巴血管進(jìn)行計數(shù)，分別選取4個視野計算血管數(shù)量，然后求平均值即為LMVD。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C、LYVE-1在病變組織的表達(dá)情況 NSCLC患者病變組織中VEGF-C蛋白表達(dá)陽性者為76.79%(43/56)，明顯高于肺良性病變組織30.00%(3/10)(P＜0.05)。LYVE-1在10例良性肺病變及56例NSCLC病變組織中均呈陽性，LYVE-1陽性血管主要分布于腫瘤邊緣，在腫瘤內(nèi)部較少。LYVE-1陽性染色淋巴血管腔壁較薄，由單層內(nèi)皮細(xì)胞組成，具有毛細(xì)血管的特點;內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中含有大量棕黃色的陽性顆粒，血管管腔內(nèi)偶爾會出現(xiàn)瘤栓，但是沒有紅細(xì)胞。NSCLC組織中MLVD(11.19±1.54)較肺良性病變組織LMVD(6.05±1.26)增多(P＜0.05)。

2.2 VEGF-C表達(dá)與LYVE-1標(biāo)記淋巴管密度的關(guān)系 VEGF-C表達(dá)陽性組MLVD(11.62±2.15)顯著高于LEGF-C陰性組 MLVD(9.76±1.36)(n=13，P＜0.05)。

2.3 VEGF-C表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PTNM分期的關(guān)系 NSCLC伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者VEGF-C蛋白陽性率為95.45%(21/22)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者VEGF-C陽性率為67.65%(23/34)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。VEGF-C蛋白在Ⅰ期+Ⅱ期NSCLC患者中的陽性率為63.64%(21/33例)，在Ⅲ期+Ⅳ期NSCLC患者中的陽性率為100%(23/23)，兩組差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

淋巴管轉(zhuǎn)移是NSCLC常見且主要的擴(kuò)散途徑，是影響NSCLC患者預(yù)后的重要因素。目前認(rèn)為，淋巴管生成受淋巴管生成因子及其受體的介導(dǎo)和調(diào)控。VEGF-C是淋巴管內(nèi)皮生長因子，其是VEGF家族成員之一，其受體為VEGFR-3，VEGF-C與其受體結(jié)合后激活下游的信號通路進(jìn)而促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖和增生;同時，VEGF-C被水解后可轉(zhuǎn)化為其成熟形式，可激活VEGF-2進(jìn)一步激活血管以及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。目前研究顯示，VEGF-C高表達(dá)腫瘤淋巴血管的形成以及密度，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移，因此認(rèn)為其過表達(dá)與腫瘤患者的預(yù)后關(guān)系密切〔3～5〕。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中VEGF-C的表達(dá)水平顯著高于肺良性病變組織，說明VEGF-C的過表達(dá)與NSCLC的發(fā)生以及進(jìn)展有密切關(guān)系。在正常組織中，VEGF-C及其受體處于失活狀態(tài)，而在病理狀態(tài)下NSCLC細(xì)胞自分泌VEGF-C，促進(jìn)腫瘤淋巴管的形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展。

LYVE-1是一種膜蛋白，主要分布于淋巴管內(nèi)外腔表面。目前研究顯示，LYVE-1在人和鼠正常以及腫瘤組織的淋巴血管中呈特異性表達(dá)〔6〕。汪源等〔7〕研究顯示，無論正常組織還是腫瘤組織的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中LYVE-1均表達(dá)陽性。本研究結(jié)果顯示，腫瘤組織中LYVE-1的表達(dá)水平顯著高于肺良性病變組織。VEGF-C表達(dá)陽性的組織中，MLVD顯著高于陰性組織。提示NSCLC細(xì)胞通過自分泌產(chǎn)生VEGF-C，與其受體結(jié)合激活下游信號通路促進(jìn)淋巴管形成，淋巴管數(shù)目增多使癌細(xì)胞接觸淋巴管的機(jī)會增多，由于淋巴管缺乏緊密連接和連續(xù)的基底膜，腫瘤細(xì)胞易于從內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入淋巴管，從而促進(jìn)肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另一方面，VEGF-C可作為一種趨化因子活化淋巴管，誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子及類似物，趨化腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管，有利于腫瘤細(xì)胞通過間質(zhì)液的流動被動轉(zhuǎn)運(yùn)到淋巴管，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。VEGF-C表達(dá)增高、淋巴管密度增加是促使NSCLC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要原因。本研究結(jié)果提示VEGF-C過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后不，與腫瘤的惡性程度明顯相關(guān)。通過抑制腫瘤細(xì)胞自分泌VEGF-C或者阻斷VEGF-C以及下游的信號通道，可抑制腫瘤淋巴血管的形成，并降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，對患者的預(yù)后有著重要意義。

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7 汪 源，潘鐵成，陳 濤.非細(xì)胞肺癌(NSCLC)的LYVE-1陽性微淋巴管密度與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009;17(7):1243-5.