神經(jīng)病理性疼痛的受體機(jī)制研究進(jìn)展

焦 悅，郭建友，李守業(yè)，朱 妍，李昌煜

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053;2.中國(guó)科學(xué)院心理研究所心理健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或產(chǎn)生病變而導(dǎo)致的疼痛。NP的主要特征包括痛過敏(hyperalgesia)、痛過度(hyperpathia)及異常痛(allodynia)［1］，由于其病因多樣，發(fā)病機(jī)制至今尚未徹底闡明，已經(jīng)成為臨床醫(yī)療最具挑戰(zhàn)的難題之一。目前臨床常用的治療藥物有抗抑郁藥、NMDA拮抗劑、阿片類鎮(zhèn)痛藥等，它們主要通過與NMDA受體或阿片受體等相互作用而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。然而這些藥物針對(duì)治療NP的靶向性并不十分明確，且大部分具有較多的不良反應(yīng)，限制了它們的廣泛應(yīng)用。隨著新型動(dòng)物模型的不斷涌現(xiàn)，對(duì)NP病理生理學(xué)研究的日趨深入，更多的受體被發(fā)現(xiàn)參與到NP發(fā)生發(fā)展的過程，這些受體的表達(dá)及其介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)與鎮(zhèn)痛效應(yīng)存在較高的相關(guān)性，為新型鎮(zhèn)痛藥的開發(fā)提供了新的作用靶點(diǎn)。

1 嘌呤與嘧啶受體(receptors for purines and pyrimidines，P受體)

P受體分為P1(腺苷)和P2(腺嘌呤核苷酸)兩大類受體，P2受體分為P2X和P2Y受體。其中，P1受體和P2Y受體均屬于G-蛋白偶聯(lián)受體，P2X受體屬于配體門控離子通道型受體。目前已成功克隆7種哺乳動(dòng)物的P2X受體(P2X1-P2X7)、8 種 P2Y 受體(P2Y1、2、4、6、11、12、13、14)［2］。近年來(lái)在NP的發(fā)病機(jī)制中，較受關(guān)注的是P2X3受體和P2Y12受體。

1.1 P2X3受體 P2X3受體是在新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)中被首次克隆，并發(fā)現(xiàn)其在處理傷害性信息的小直徑感覺神經(jīng)元上具有高度選擇性表達(dá)［3］。P2X3受體作為一種非選擇性陽(yáng)離子通道，對(duì)Na+、K+和Ca2+均有通透性，但以Ca2+的通透性最為明顯［4］。研究發(fā)現(xiàn)，三磷酸腺苷(ATP)在體內(nèi)不僅是一種儲(chǔ)能、供能物質(zhì)，還可作用于P受體，產(chǎn)生藥理作用。當(dāng)P2X3受體被細(xì)胞外ATP激活后誘發(fā)內(nèi)向跨膜離子流，使傷害性疼痛神經(jīng)末梢細(xì)胞去極化，電壓門控Ca2+通道被打開，細(xì)胞外的Ca2+通過P2X3受體和Ca2+通道內(nèi)流，激活初級(jí)傳入神經(jīng)元從而激活痛覺通路。NP動(dòng)物模型P2X3受體的表達(dá)與神經(jīng)元電生理學(xué)特性表現(xiàn)異常。應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)大鼠，發(fā)現(xiàn)其損傷側(cè) L4、L5、L6節(jié)段DRG神經(jīng)元及脊髓背角淺層的P2X3受體表達(dá)明顯增加;而利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)量發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間相應(yīng)節(jié)段DRG神經(jīng)元產(chǎn)生ATP快反應(yīng)電流細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，電流幅度亦增強(qiáng)。推測(cè)DRG神經(jīng)元中P2X3受體表達(dá)增加所致的ATP反應(yīng)敏感性增強(qiáng)及興奮性提高，可能在CCI所致NP的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［5］。

P2X3受體拮抗劑通過抑制P2X3受體激動(dòng)劑產(chǎn)生的傷害性激活電流而達(dá)到鎮(zhèn)痛效果。如A-317491、三氮ATP(TNP-ATP)、砒哆醛衍生物(PPADS)在多種NP模型中顯示了緩解疼痛的效應(yīng)。其中，A-317491作為P2X3同源二聚體和P2X2/3異聚體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，能有效阻斷 P2X3和P2X2/3受體介導(dǎo)的鈣離子流。與 TNP-ATP相比，A-317491僅僅對(duì)P2X3和P2X2/3受體有高度的選擇性(TNP-ATP對(duì)P2X1受體同樣高度親和)，且其對(duì)去磷酸化作用不敏感，因而體內(nèi)代謝更穩(wěn)定［6］。此外，鞘內(nèi)給予 A-317491可減輕CCI與L5-L6脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation，SNL)等NP模型的機(jī)械性異常痛。在CCI模型中，A-317491對(duì)熱痛覺過敏和機(jī)械性痛覺超敏的減輕最有效，而對(duì)于急性痛、手術(shù)后疼痛與內(nèi)臟痛動(dòng)物模型均無(wú)效［6-7］。但遺憾的是，A-317491口服生物利用度與中樞神經(jīng)系統(tǒng)穿透力非常有限。最近，Ballini等［8］發(fā)現(xiàn)了3種diaminopyrimidine類化合物可選擇性地有效拮抗P2X2/3受體，并且比A-317491具有更好的生物利用度。它們?cè)谕耆ナ献魟?dǎo)致的體內(nèi)疼痛模型中表現(xiàn)出明顯作用，并有效驗(yàn)證了P2X2/3受體在炎性痛和神經(jīng)病理性疼痛中的靶點(diǎn)效應(yīng)。

另一方面，近幾年研究表明多種化合物參與了P2X3受體在NP中的作用過程。如前列腺素E2(PGE2)可通過結(jié)合EP3受體而激活 cAMP/PKA信號(hào)通路，增強(qiáng)P2X3受體在DRG神經(jīng)元介導(dǎo)的ATP電流，并且增強(qiáng)α，β-meATP(一種P2X受體激動(dòng)劑)誘導(dǎo)的異常痛和痛過敏［9］。Marianna等［10］使用HEK細(xì)胞和體外激酶分析觀察到，C端酪氨酸抑制激酶(Csk)直接磷酸化P2X3受體酪氨酸393位殘基并能強(qiáng)烈抑制受體電流，他們推測(cè)若Csk是P2X3受體內(nèi)源性抑制劑，那么調(diào)節(jié)其活性可成為一種新的鎮(zhèn)痛方法。另外，中藥川芎中所含的生物堿-川芎嗪可抑制CCI大鼠L4/L5段DRG中P2X3受體的表達(dá)［11］，并通過減小DRG神經(jīng)元P2X3受體增敏的激活電流而抑制受體介導(dǎo)的NP，值得一提的是，川芎嗪并不影響正常大鼠的P2X3受體表達(dá)［12］。

1.2 P2Y12受體 P2Y12受體屬于視紫紅質(zhì)類G蛋白偶聯(lián)受體家族。在脊髓，P2Y12受體選擇性表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞［13］，參與神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的補(bǔ)充和活化。有研究表明，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞P2Y12受體參與了NP的發(fā)生，有潛力成為鎮(zhèn)痛藥開發(fā)的新靶點(diǎn)。

外周神經(jīng)損傷的小鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞釋放ATP或其水解產(chǎn)物ADP，使P2Y12受體表達(dá)上調(diào)，此過程激活下游的p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)，從而進(jìn)一步活化小膠質(zhì)細(xì)胞，使其產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子或其他炎性介質(zhì)而導(dǎo)致NP癥狀的出現(xiàn)［14］。此外，神經(jīng)損傷激活的脊髓背角神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞通過P2Y12受體信號(hào)依賴性方式吞噬有髓鞘的軸突，可能是NP的重要發(fā)病機(jī)制［15］。

P2Y12受體拮抗劑在臨床上已經(jīng)用于抗血栓形成，近年來(lái)關(guān)于它在治療NP方面的潛在價(jià)值引起了普遍關(guān)注。對(duì)坐骨神經(jīng)部分損傷模型(partial sciatic nerve ligation，PSNL)大鼠，鞘內(nèi)注射P2Y12受體選擇性拮抗劑MRS2395或反義核酸(AS-ODN)可明顯抑制p38MAPK磷酸化以及小膠質(zhì)細(xì)胞激活，從而減輕坐骨神經(jīng)部分損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性異常痛和熱痛過敏反應(yīng)。另一受體拮抗劑AR-C69931MX可通過減少附著于有髓鞘軸突上的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，降低小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)軸突的吞噬作用，來(lái)抑制觸覺性異常痛［14］。Tsuda等［16］發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)損傷小鼠中鞘內(nèi)單一給予AR-C69931MX或者口服氯吡格雷(P2Y12受體拮抗劑，一種臨床的抗血栓形成藥)能明顯緩和觸覺性異常痛。當(dāng)氯吡格雷口服劑量為10 mg·kg-1時(shí)可產(chǎn)生明顯效果，口服劑量增大時(shí)(25 mg·kg-1)可達(dá)到更持久的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。先前已有研究證實(shí)氯吡格雷對(duì)P2Y12受體的拮抗效應(yīng)依賴于其通過肝臟代謝后形成的活化代謝物［17］，但Tsuda等認(rèn)為氯吡格雷的止痛作用可能是一種脫靶效應(yīng)，因?yàn)樗淖饔媚繕?biāo)是血小板中的P2Y12受體。

2 GABA受體

γ-氨基丁酸(γ-amino-butylic acid，GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要通過與其特異性受體相互作用發(fā)揮重要的生理活性。目前將GABA受體分為3個(gè)藥理學(xué)亞型:GABAA，GABAB和GABAC。近年來(lái)對(duì)NP的研究主要集中在GABAA、GABAB兩種受體。通過靜脈注射西地那非可使SNL模型大鼠縮爪閾值增加，而GABAA受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑荷包牡丹堿與GABAB受體拮抗劑saclofen能有效阻斷西地那非的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，提示GABAA和GABAB受體參與了西地那非的鎮(zhèn)痛作用［18］。

2.1 GABAA受體 GABAA受體是一種離子通道受體，由8個(gè)亞基組成跨膜的氯離子通道。GABAA亞基有21種(α1-6、β1-4、γ1-4、δ、ε、ρ1-3、θ、π)，尤以分布于前腦和小腦中的 α 亞型在NP的發(fā)病機(jī)制研究中最受關(guān)注。通過定點(diǎn)突變技術(shù)改造小鼠基因后發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的苯二氮卓類藥物地西泮對(duì)NP小鼠具有一定的的抗異常痛及抗痛過敏作用，這一作用可能是通過含有α2、α3和α5亞基的GABAA受體所介導(dǎo)，而并非通過可導(dǎo)致鎮(zhèn)靜作用的含有α1亞基的GABAA受體所介導(dǎo)［19］。這說明含有α2、α3和 α5亞基的 GABAA受體在 NP的鎮(zhèn)痛機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。近幾年來(lái)的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。

為了避免苯二氮卓類藥物的鎮(zhèn)靜作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾，Knabl等［20］利用GABAA受體基因定點(diǎn)突變和敲入技術(shù)，使小鼠攜帶特異性的苯二氮卓結(jié)合位點(diǎn)配體不敏感的GABAA受體亞基組合，并利用選擇性激動(dòng)劑L-838，417進(jìn)行生物篩選后，發(fā)現(xiàn)α2和(或)α3亞基表現(xiàn)出明顯對(duì)抗NP的效應(yīng)，結(jié)果表明α2、α3亞基是L-838，417的作用靶點(diǎn)。通過外周軸突顯微外科術(shù)使SD大鼠外周神經(jīng)損傷后，采用cDNA微陣列技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)其脊髓背角與背根神經(jīng)節(jié)GABAA受體α5亞基表達(dá)明顯增加，這可能是SD大鼠NP發(fā)生的基礎(chǔ)［21］。此外，作為GABAA受體正性別構(gòu)調(diào)節(jié)劑，NS11394與TPA023在神經(jīng)損傷后動(dòng)物脊髓中，通過恢復(fù)突觸后α2、α3亞基GABAA受體功能來(lái)介導(dǎo)有效的鎮(zhèn)痛作用。GABAA受體負(fù)性別構(gòu)調(diào)節(jié)劑FG-7142則能作用于初級(jí)傳入神經(jīng)元的GABAA受體，抑制突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，并通過初級(jí)神經(jīng)末端去極化(primary afferent depolarization，PAD)過程產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［22］。值得一提的是，化合物與GABAA受體選擇性結(jié)合發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用所依賴的因素，不僅與其特異性亞基相關(guān)，同時(shí)也與化合物自身內(nèi)在活性關(guān)系密切。例如，內(nèi)在活性較低的GABAA受體別構(gòu)調(diào)節(jié)劑溴他西尼，盡管具有良好的抗焦慮活性，但卻缺乏抗痛過敏作用［22］。

然而，傳統(tǒng)的苯二氮卓類藥物在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出緩解NP效應(yīng)的同時(shí)，也因其可致鎮(zhèn)靜、運(yùn)動(dòng)能力失調(diào)、軀體依賴等副作用，使得該類藥物在鎮(zhèn)痛方面的應(yīng)用受到嚴(yán)重制約。作為GABAA受體的部分激動(dòng)劑，L-838，417 不僅對(duì) α2、α3和 α5亞基有高親和力，能高效拮抗炎性痛與神經(jīng)病理性疼痛，而且是α1亞基受體的拮抗劑，故在臨床試驗(yàn)中并無(wú)上述副作用［24］。更有利的是，它在減少輸入腦內(nèi)的疼痛反應(yīng)的同時(shí)，也能抑制與疼痛聯(lián)想情緒相關(guān)的腦區(qū)的活動(dòng)［20］。因此可以推測(cè)，傳統(tǒng)的苯二氮卓類藥物的副作用與它們激動(dòng)α1亞基有關(guān)，而α1亞基的拮抗劑可避免這些副作用。因此，對(duì)于α2、α3和α5亞基有高親和力而對(duì)α1亞基有拮抗作用的鎮(zhèn)痛藥，具有較好的開發(fā)前景。

2.2 GABAB受體 GABAB受體是一種G-蛋白偶聯(lián)受體，以兩個(gè)亞型GABAB1與GABAB2的異二聚體形式發(fā)揮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)功能。GABAB1受體又存在兩個(gè)剪切異構(gòu)體:GABAB1a和GABAB1b。聯(lián)合運(yùn)用遺傳學(xué)、生理學(xué)和形態(tài)學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，GABAB1a主要在海馬 GA3-CA1區(qū)調(diào)控谷氨酸的釋放，而GABAB1b主要介導(dǎo)突觸后抑制［25］。多項(xiàng)研究表明不同 NP動(dòng)物模型的GABAB受體各亞型基因表達(dá)不完全一致。

在鏈脲霉素介導(dǎo)的糖尿病神經(jīng)痛模型大鼠中，脊髓背角神經(jīng)元GABAB1受體mRNA水平以時(shí)間依賴性方式降低，大鼠痛閾也明顯下降。說明GABAB1受體的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致脊髓背角神經(jīng)元活動(dòng)過于亢進(jìn)和糖尿病神經(jīng)痛［26］。通過行為學(xué)、免疫組織化學(xué)和免疫印跡沉淀法，發(fā)現(xiàn)CCI模型大鼠脊髓水平GABAB1a、GABAB2表達(dá)減少，GABAB1b亞型無(wú)明顯改變［27］。在 SNL 模型大鼠中，L5結(jié)扎側(cè) GABAB1a、GABAB1b亞型蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且并未發(fā)現(xiàn)GABAB2蛋白的表達(dá)。提示在此模型中GABAB受體各亞型可能沒有參與機(jī)械性異常痛的發(fā)生與維持［28］。不同模型中GABAB各亞型在NP發(fā)生過程中的蛋白翻譯和轉(zhuǎn)錄水平變化不一致，其原因可能是不同的造模方式使GABAB1與GABAB2兩亞型的聚合狀態(tài)發(fā)生改變所致。而在同一NP病理狀態(tài)下GABAB受體各亞型蛋白表達(dá)不同，說明GABAB各亞型在NP的形成和維持中發(fā)揮的功能不同，但是各受體介導(dǎo)的具體功能如何仍需進(jìn)一步探究。

在GABAB對(duì)NP鎮(zhèn)痛機(jī)制方面，以往研究主要集中在GABAB受體激動(dòng)劑。例如巴氯芬作為一種GABAB受體選擇性激動(dòng)劑，激活位于突觸前末梢上的GABAB受體，增加K+外流，并通過阻滯Ca2+通道、減少Ca2+內(nèi)流，而減少興奮性遞質(zhì)的釋放，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。但因其在鎮(zhèn)痛劑量可產(chǎn)生較為嚴(yán)重的副作用，在臨床應(yīng)用中具有一定的局限性。最近，一些新的受體機(jī)制相繼被發(fā)現(xiàn)。在SNL模型大鼠中，采用up-down法并利用Von-Frey細(xì)絲測(cè)試發(fā)現(xiàn)大鼠機(jī)械痛閾明顯下降，脊髓背角GABAB1受體蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。而鞘內(nèi)注射特異性小膠質(zhì)細(xì)胞p38/MAPK抑制劑SB203580可有效阻止SNL大鼠GABAB1的下調(diào)，緩解神經(jīng)病理性疼痛。提示GABAB1受體的下調(diào)可能與小膠質(zhì)細(xì)胞p38/MAPK的激活有關(guān)，小膠質(zhì)細(xì)胞可能通過抑制GABAB1的表達(dá)參與NP的發(fā)生。由此推測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑與GABAB激動(dòng)劑的聯(lián)合用藥可能成為治療 NP 更有效的方法［29］。Callaghan等［30］發(fā)現(xiàn)，α蝸牛毒素Vc1.1和Rg1A通過G-蛋白偶聯(lián)激活GABAB受體對(duì)N型Ca2+通道產(chǎn)生抑制作用。最新研究證實(shí)，Vc1.1可通過抑制N型Ca2+通道產(chǎn)生持續(xù)高效的抗異常痛作用，對(duì)模型大鼠預(yù)處理GABAB受體拮抗劑SCH50911能逆轉(zhuǎn)此鎮(zhèn)痛效應(yīng)，提示α蝸牛毒素對(duì)N型Ca2+通道的抑制作用依賴于GABAB受體的激活［31］。

3 PAF受體

血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)是一種具有多種生物學(xué)活性的內(nèi)源性磷脂介質(zhì)，通過一種具有高度專一性的PAF受體發(fā)揮其生物效應(yīng)。早期研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠大腦皮層PAF受體中存在3個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)，分別位于突觸質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)微粒體上，且PAF與這些位點(diǎn)的特異性結(jié)合可被其受體拮抗劑所阻斷［32］。PAF及其受體可參與NP的中樞敏化機(jī)制，對(duì)小鼠鞘內(nèi)注射PAF可導(dǎo)致觸覺異常痛［33］。近年研究發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)損傷介導(dǎo)胞質(zhì)磷脂酶A2(cPLA2)的活化，并通過一系列反應(yīng)促使PAF在DRG神經(jīng)元中釋放，激活PAF受體，進(jìn)而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生和釋放，增強(qiáng)DRG神經(jīng)元的興奮性，產(chǎn)生觸覺異常痛［34］。

銀杏內(nèi)酯B(BN52021)是一種天然的PAF受體非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，對(duì)上述3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)均能產(chǎn)生拮抗作用，且對(duì)突觸質(zhì)膜位點(diǎn)作用更強(qiáng)。而另一種人工合成的PAF受體拮抗劑BN50730則能選擇性作用于PAF受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)。通過對(duì)保留性神經(jīng)損傷(spared nerve injury，SNI)模型大鼠鞘內(nèi)注射BN52021，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNI大鼠機(jī)械縮爪閾值明顯降低，同側(cè)脊髓背角淺層內(nèi)Fos(脊髓原癌基因)陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多，TNF-α表達(dá)增強(qiáng)。鞘內(nèi)給予BN52021可明顯減少大鼠脊髓背角神經(jīng)元c-Fos的表達(dá)，同時(shí)減輕機(jī)械異常痛敏。而鞘內(nèi)給予BN50730也能使SNI大鼠疼痛行為得到改善，并且明顯抑制SNI引起的脊髓TNF-α含量升高。表明銀杏內(nèi)酯B與BN50730對(duì)SNI大鼠NP有治療作用，且脊髓背角c-Fos和TNF-α的表達(dá)下調(diào)可能與其鎮(zhèn)痛機(jī)制有關(guān)［35-36］。

近年來(lái)人們對(duì)NP機(jī)制的研究有所深入，各受體所介導(dǎo)的生理功能失常為NP的病理機(jī)制提供了較好的解釋。但由于在NP發(fā)生發(fā)展過程中參與的受體種類繁多，各受體的功能之間是否存在相互聯(lián)系、相互影響，它們的具體作用位點(diǎn)和機(jī)制到底如何，尚須深入研究。只有進(jìn)一步認(rèn)識(shí)各受體在NP中的作用，找到相應(yīng)的具有高度特異性的受體亞型激動(dòng)劑或拮抗劑，明確其藥理特性及臨床價(jià)值，才有可能實(shí)現(xiàn)NP的靶向藥物治療，提高用藥的針對(duì)性，減少不良反應(yīng)。相信運(yùn)用神經(jīng)藥理學(xué)、神經(jīng)化學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)方法深入研究各受體表達(dá)異常的規(guī)律及其意義，將有助于促進(jìn)NP的病理機(jī)制闡釋，以及新型的安全高效的靶向藥物的開發(fā)。

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