苦豆籽中抑菌活性物質(zhì)的跟蹤篩選研究

史高峰，張 梅，陳學(xué)福，王國英，陳英贊

(蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州730050)

苦豆子(Sophora alopecuroides)是豆科槐屬野生草本植物，廣泛分布于我國西北的甘肅、寧夏、新疆等地，具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、平喘止咳、止痛殺蟲等作用［1－2］。現(xiàn)代藥理研究表明，苦豆子生物堿具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗菌等藥理活性［3－5］，尤其是在殺蟲抑菌方面，具有很好的生物活性，已在農(nóng)業(yè)上獲得了廣泛的應(yīng)用。本文旨在篩選苦豆籽中有效成分的抑菌活性，對其抑菌作用進行系統(tǒng)的研究，并通過跟蹤分離篩選出苦豆籽中最佳抑菌物質(zhì)，為其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和日用化學(xué)等行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗藥物

苦豆籽(苦豆子的成熟種子)，產(chǎn)于寧夏鹽池，粉碎，過60目篩保存待用。苦參堿、氧化苦參堿(本實驗室自制，純度＞90%);氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(C83)、綠膿桿菌(10104)、白色念珠菌(10231)由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

水解酪蛋白瓊脂、慶大霉素紙片(杭州微生物試劑廠);牛肉膏，蛋白胨、NaCl(杭州微生物試劑廠);蒸餾水等。

1.1.4 實驗儀器

JH－DCB超凈工作臺、YLD－6000SHP恒溫生化培養(yǎng)箱(揚州鴻都電子有限公司);RE－3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHZ－DⅢ循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);YX280A手提式不銹鋼蒸氣消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥品的制備

1.2.1.1 粗提物藥液的制備 準(zhǔn)確稱取100 g粉碎的苦豆籽，置于1000 mL的圓底燒瓶中，采用質(zhì)量分數(shù)為60%的乙醇溶液進行熱回流提取，固液比為1∶6，提取時間為2 h，共提4次，過濾，合并濾液并減壓濃縮，所得濃縮液取少量制成浸膏備用，剩余的濃縮液依次用石油醚、氯仿、正丁醇進行萃取，每種溶劑萃取至無色為止，所得萃取液分別濃縮，制得浸膏備用。

取60%乙醇浸膏、石油醚浸膏、氯仿浸膏、正丁醇浸膏溶于二甲基亞砜中，配制成濃度為300 mg/mL的藥液，備用。

1.2.1.2 單體類藥液的制備 取本實驗室自制的苦參堿單體，氧化苦參堿單體及氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物溶于無菌水中，配制成20 mg/mL的藥液，備用。

1.2.2 菌液的制備

取實驗菌種接種于MH瓊脂平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20 h，用MH液體培養(yǎng)基制備菌懸液，菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?108cfu/mL)備用，5℃冰箱保存(不超過 12 h)［6］。

1.2.3 含藥紙片的制備

將吸水性強的濾紙用打孔器打成直徑為6 mm的圓形小紙片，分裝于潔凈干燥的小培養(yǎng)皿中，經(jīng)121℃高壓滅菌20～25 min后，取出，放入干燥箱內(nèi)進行干燥，備用。每張濾紙片分別加藥液各10 μL，空白對照組加無菌蒸餾水10 μL，陰性對照組加分析純 DMSO 10 μL，陽性對照組加慶大霉素 10 μL［7］。

1.2.4 菌落記數(shù)

將實驗的菌液稀釋 10－5和10－6倍接種于 MH瓊脂平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20 h，記數(shù)瓊脂平板培養(yǎng)基菌株的個數(shù)。

1.2.5 最低抑菌濃度(MIC)的測定

將實驗所用各種藥液用適量的溶劑(DMSO)進行二倍稀釋后，每張紙片分別加已稀釋成不同濃度的藥液10 μL，空白對照組加無菌蒸餾水10 μL，陰性對照組加分析純DMSO 10 μL，置37℃恒溫生化培養(yǎng)箱20 h，完全沒有抑菌直徑的最低濃度為該物質(zhì)的最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.6 K －B 實驗法

取濃度為108cfu/mL的菌液100 μL，均勻涂布整塊MH瓊脂培養(yǎng)基表面，室溫3～5 min后，貼加含藥紙片，置入37℃恒溫生化培養(yǎng)箱20 h，觀察菌落生長情況，測定紙片周圍抑菌圈直徑大小，各稀釋液的每項抑菌實驗平行重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦豆籽粗提物的抑菌作用

取300 mg/mL的60%乙醇浸膏(A)、石油醚浸膏(B)、氯仿浸膏(C)、正丁醇浸膏(D)按照1.2.6方法進行實驗。其對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌實驗數(shù)據(jù)見表1。

表1 苦豆籽粗提物對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌作用

由表1可知，苦豆籽粗提物對實驗所用菌種都有不同程度的抑制作用。對大腸桿菌的抑制作用為:C﹥D﹥A﹥B，即氯仿浸膏﹥正丁醇浸膏﹥60%乙醇浸膏﹥石油醚浸膏;對綠膿桿菌的抑制作用由大到小依次為:60%乙醇浸膏﹥氯仿浸膏﹥正丁醇浸膏﹥石油醚浸膏;對金黃色葡萄球菌的抑制作用由大到小依次為:氯仿浸膏﹥60%乙醇浸膏﹥正丁醇浸膏，石油醚浸膏的抑菌圈直徑很小，無法測量，其抑菌作用非常微弱;對白色念珠菌的抑制作用由大到小依次為:氯仿浸膏﹥60%乙醇浸膏﹥正丁醇浸膏，石油醚浸膏抑菌作用微弱。

由上述實驗結(jié)果可知:氯仿浸膏的抑菌作用是較強且廣的，可能是因為氯仿浸膏中含大量生物堿，因此具有強抑菌作用。而石油醚浸膏中主要為低極性的脂溶性成分，因此抑菌作用較弱。

2.2 苦豆籽單體類化合物的抑菌作用

取20 mg/mL的苦參堿單體(E)，氧化苦參堿單體(F)及氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物(G)按照1.2.6方法進行實驗。其對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌實驗數(shù)據(jù)見表2。

表2 苦豆籽單體對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌作用

由表2可知:苦豆籽單體類化合物對實驗所用菌種都具有較強的抑制作用。對大腸桿菌的抑制作用:E﹥F﹥G，即苦參堿﹥氧化苦參堿﹥氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物;對綠膿桿菌的抑制作用由大到小依次為:苦參堿和氧化苦參堿抑菌作用基本相當(dāng)﹥氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物;對金黃色葡萄球菌的抑制作用由大到小依次為:苦參堿﹥氧化苦參堿﹥氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物;對白色念珠菌的抑制作用由大到小依次為:苦參堿﹥氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物﹥氧化苦參堿。

由上述實驗結(jié)果可知，苦參堿的抑菌作用是最強的，其次是氧化苦參堿，且對細菌的抑制作用要比真菌稍強，但對綠膿桿菌的抑制作用較弱。氧化萊曼堿對白色念珠菌的抑制作用較好，可進一步分離得到單體，進行藥理活性研究。

2.3 苦參堿和氧化苦參堿的最低抑菌濃度(MIC)的測定

取5.0 mg/mL的苦參堿溶液和氧化苦參堿溶液作為原樣液，采用二倍稀釋方法按照1.2.6方法進行實驗。其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和白色念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)實驗數(shù)據(jù)見表3、表4。

由表3可知，最低抑菌濃度表明:V苦參堿對大腸桿菌的抑菌能力大于綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌。對大腸桿菌的最低抑菌濃度為19.55 μg/mL，對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑菌濃度為39.1 μg/mL。

表3 苦參堿對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的影響(MIC)

表4 氧化苦參堿對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的影響(MIC)

由表4可知，最低抑菌濃度表明:氧化苦參堿對大腸桿菌的抑菌能力大于綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌，對白色念珠菌抑菌能力最弱。對大腸桿菌的最低抑菌濃度為39.1 μg/mL，對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑菌濃度為78.2 μg/mL。

3 結(jié)論

本文通過對苦豆籽的不同極性部位藥用成分及單體類化合物進行活性物質(zhì)的跟蹤抑菌實驗，為進一步篩選天然抑菌劑的研究奠定了良好的基礎(chǔ)，并得出以下結(jié)論:

苦豆籽不同極性溶劑萃取物對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌都有不同程度的抑制作用，其中氯仿浸膏的抑制作用較強，石油醚浸膏的抑制作用最弱;從苦豆籽中自制的苦參堿、氧化苦參堿以及氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物對實驗所用菌種也都有較強的抑制作用，其中苦參堿的抑制作用最強，并測定了苦參堿和氧化苦參堿對4種菌種的最低抑菌濃度(MIC)?？芍喽棺阎兄饕志煞譃樯飰A類化合物，其中苦參堿的抑菌效果優(yōu)于氧化苦參堿，因其獨特的結(jié)構(gòu)特征及化學(xué)性質(zhì)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)，加強其活性研究具有重大的社會意義和經(jīng)濟效益，并為篩選有效的天然抑菌物質(zhì)提供了實驗依據(jù)。

［1］ 劉軍鋒，丁澤，歐陽艷，等.苦豆子生物堿抗茵活性的測定［J］.北京化工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，38(2):84－88.

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