Stl阻遏因子控制葡萄球菌引起中毒性休克的“致病性島”*

龍 莉，張吉翔

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，3江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006)

葡萄球菌中毒性休克綜合癥(staphylococcal toxic shock syndrome，STSS)是一種潛在的致命疾病，以發(fā)燒、低血壓、剝脫性皮疹、腹瀉、嘔吐，最終導(dǎo)致休克和多臟器系統(tǒng)功能障礙等為特征。其女性發(fā)病率顯著高于男性，其中90%與月經(jīng)來潮有關(guān)，近年來檢測資料顯示，皮膚和外科感染引起的STSS有增多趨勢。

與STSS相關(guān)的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)中，大部分屬噬菌體Ⅰ群29型或52型。這些類型的SA能產(chǎn)生多種外毒素，其中包括中毒性休克綜合征毒素－1(toxic shock syndrome toxin－1，TSST－1)。它屬于一種超抗原(superantigen，SAg)，能超常激活T細(xì)胞，產(chǎn)生超生理量的細(xì)胞因子而發(fā)揮瀑布效應(yīng)，故在ng/L水平即可產(chǎn)生強(qiáng)大生物學(xué)效應(yīng)而發(fā)生嚴(yán)重的低血壓和休克。

1 葡萄球菌致病性島與中毒性休克

細(xì)菌的致病性是由其毒力因子決定的，而控制這些毒力因子(如菌毛、毒素、酶等)的基因可以是染色體上某些特殊的位點(diǎn)，也可以是由細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)?；蚴删w所攜帶的遺傳成分，稱之為“致病性島”(pathogenicity island)。金黃色葡萄球菌超抗原是其引起中毒性休克的致病性島(Staphylococcus aureus pathogenicity islands，SaPIs)，它含有 14 ～27 kb 可移動遺傳因子家族，含有中毒性休克綜合征毒素基因(tst基因)，其臨界部分有17 bp同向重復(fù)序列，插入tyr B和trp位點(diǎn)，包含超抗原毒素基因、抗生素抗性基因及其它關(guān)于侵襲宿主的致病因素的基因[1－2]，在引起重大健康危害如中毒性休克綜合癥的細(xì)菌種群間傳播致病基因中起著決定性作用。SaPIs與其它移動遺傳因素相結(jié)合導(dǎo)致對多種抗生素有多重耐藥性的攻擊性菌株擴(kuò)散和增殖的快速出現(xiàn)[3]，最顯著的是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)。因此，關(guān)于葡萄球菌致病性的傳播和定植的動員機(jī)制等元素的詳盡探索及說明至關(guān)重要。

葡萄球菌超抗原攜帶的SaPIs是不連續(xù)的，其編碼大約15000對堿基對，通常是堅(jiān)定的整合在宿主基因中，其流動性和可伸展性是通過輔助噬菌體的誘導(dǎo)活化后，開始染色體整合基因的剪切及復(fù)制，然后SaPI的DNA被有效地殼體化，包裝在由噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白組成的具有小衣殼的噬菌體樣轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子中，導(dǎo)致頻率極高的內(nèi)部以及屬間轉(zhuǎn)移[4－5]。這個(gè)事件序列指的是SaPI剪切－復(fù)制－包裝循環(huán)周期(excision－replication－packaging，ERP)。由于其高頻率的轉(zhuǎn)移，SaPIs分布非常廣泛，在金黃色葡萄球菌菌株中含有2個(gè)或更多[6]。

2 Stl阻遏因子與葡萄球菌致病性島

SaPIs通常包括18～22個(gè)開放閱讀框架(open reading frames，ORFs)。把這些ORFs每一個(gè)都系統(tǒng)滅活，以明確它們的作用分型，發(fā)現(xiàn)2個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)噬菌體誘導(dǎo)SaPIs ERP周期的ORFs。這2個(gè)基因組是分開來轉(zhuǎn)錄的，并且構(gòu)成主要的SaPI基因組翻譯機(jī)構(gòu):其中一個(gè)就是SaPIbov1 ORF19，定向向右側(cè)方位，另一個(gè)是ORF20，定向向左側(cè)方位。這2個(gè)預(yù)測產(chǎn)物都包含1個(gè)典型的螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋基序轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，并因此被命名為Str(SaPI transcription rightward，SaPI右轉(zhuǎn)錄;ORF19)和 Stl(SaPI transcription leftward，SaPI左轉(zhuǎn)錄;ORF20)。然而研究發(fā)現(xiàn)，ORF19的框內(nèi)缺失并未影響噬菌體誘導(dǎo)SaPI的復(fù)制，而 Stl(ORF20)主要調(diào)節(jié) SaPIs ERP 周期[7]。

在輔助噬菌體裂解增長的情況下，致病性島內(nèi)維持在一個(gè)靜止原噬菌體樣的穩(wěn)定狀態(tài)，這是由一個(gè)類似于經(jīng)典前噬菌體抑制物的普遍性阻遏因子Stl控制，它連接在2個(gè)引進(jìn)SaPI轉(zhuǎn)錄啟動因子之間的分叉部分，然后抑制大部分SaPI基因的表達(dá)[8]。突變SaPI的Stl被滅活，卻能在缺乏輔助噬菌體的情況下剪切和復(fù)制，表明輔助噬菌體的主要調(diào)控功能是緩解 Stl的抑制作用。SaPIbov1 ORF20和 SaPI1 ORF22::tetm在補(bǔ)體激活菌株中復(fù)制大大被抑制。有趣的是，雖然SaPIbov1 ORF20和SaPI1 ORF22的產(chǎn)物無相關(guān)序列，但是它們可能在某種程度上有交叉反應(yīng)[7]。由此可知，Stl編碼的主要阻遏物基因突變而失活后，SaPI的切除和復(fù)制可以在任何誘導(dǎo)噬菌體缺失的情況下發(fā)生，而誘導(dǎo)噬菌體的關(guān)鍵作用是減輕這種抑制作用，沒有誘導(dǎo)作用的噬菌體因?yàn)椴荒苷T導(dǎo)去Stl阻遏作用而不能誘導(dǎo)致病性島基因的ERP周期。

現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，SaPI的脫阻遏由一個(gè)特定的、非必要的噬菌體蛋白質(zhì)結(jié)合到Stl，導(dǎo)致Stl－DNA復(fù)合物的破裂，這是SaPI活化的第一步，進(jìn)而開始致病性島基因的ERP周期;并在不同情況下，SaPI結(jié)合不同的、非必需的噬菌體蛋白質(zhì)作為它的脫阻遏蛋白。因?yàn)樗鼈冇?個(gè)不同的、在遺傳上有各自鮮明特征的活性，所以被稱為“兼職”蛋白[8]。

目前研究比較明確的是2種輔助噬菌體80a(GenBank accession NC_009526)和w11(NC_004615)，以及3種不同的 SaPIs－SaPI1、SaPIbov1和SaPIbov2[2]。所有的 SaPIs都編碼 Stl同系物，但是這些蛋白十分保守，然而w11僅誘導(dǎo)SaPIbov1，80a誘導(dǎo)至少5種不同的有較多分叉的Stl蛋白的SaPIs(SaPI1、SaPI2、SaPIbov1、SaPIbov2、SaPIn17)。研究已證實(shí)輔助噬菌體和SaPI的特異性，因此推測噬菌體80a有多個(gè)SaPIs脫阻遏的基因。一個(gè)典型的SaPIs——SaPI1，有15.2 kb的基因組編碼21個(gè)ORFs，包含中毒性休克綜合征毒素基因、腸毒素K和Q基因[1]。在活化過程中，80a蛋白Sri(gp22)充當(dāng)SaPI1阻遏因子Stl(SaPI1 gp22)的脫阻遏物的角色[8－9]。脫阻遏后就開始SaPI1剪切和復(fù)制，這個(gè)過程不需要80a基因產(chǎn)物[1]，然后是SaPI1 DNA的包裝，此過程需要SaPI1編碼的TerS蛋白質(zhì)[10]。

為了明白Stl的調(diào)控作用，研究者們使用質(zhì)粒pjp446、pjp447、pjp448 和 pjp449，分析 Stl、Str、xis 和rep在SaPIbov1或SaPIbov1d20存在時(shí)的表達(dá)。這些質(zhì)粒引入rn4220含有野生SaPIbov1(jp45)株或Stl突變株。Str、xis和 rep在野生SaPIbov1株中表達(dá)是被抑制的，但在Stl突變株中表達(dá)卻沒有被抑制。相反，通過 SaPIbov1 D20的突變，Stl表達(dá)可被抑制[7]?？梢?，Stl在SaPIbov1基因表達(dá)中有廣泛的抑制作用。如果抑制Stl阻遏作用，SaPIbov1和SaPI1能夠在沒有任何誘導(dǎo)噬菌體時(shí)自主復(fù)制。Stl是SaPI基因表達(dá)的主要阻遏物，也是一個(gè)自身感應(yīng)－自動誘導(dǎo)并有助于保持SaPI基因組處于關(guān)閉狀態(tài)。它預(yù)示SaPI誘導(dǎo)作用的初級目標(biāo)是解除Stl的阻遏作用。

3 Stl與脫氧尿苷焦磷酸酶 (dUTP pyrophosphatase，dUTPase)及 dut基因

近來有學(xué)者提出與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的阻遏因子Stl結(jié)合編碼SaPI基因組區(qū)域內(nèi)特定啟動子這一過程由兼職蛋白質(zhì)相互作用調(diào)制。在這種相互作用中，φ11輔助噬菌體dUTPase蛋白與致病性島SaPIbov1的Stl阻遏因子結(jié)合，抑制SaPIbov1阻遏物作用[11－12]。

dUTPase活性和去抑制作用是dut基因產(chǎn)物的2個(gè)相互獨(dú)立功能。這一觀點(diǎn)的證據(jù)由80a的Dut的其中一個(gè)突變體提供，后者被選擇用于阻斷SaPI-bov1的干擾。該突變體也是D95E替代物，雖然它對于SaPI的去抑制是有缺陷的，但其可獲得dUTP酶活性。這證實(shí)了dUTP酶活性和去抑制作用是2個(gè)相互獨(dú)立的功能。因此，Dut代表了具有2種不同功能且在遺傳方面有獨(dú)立活性的一種真正“兼職”蛋白[8]。研究者預(yù)計(jì)Dut介導(dǎo)的去抑制涉及干擾Stl表達(dá)或Stl分裂，而不是功能的干擾，如Stl缺乏與噬菌體抑制物一致的共識裂解模式，SaPI誘導(dǎo)不涉及應(yīng)急反應(yīng)(SOS response)[5]。利用純化 His標(biāo)記的蛋白和一個(gè)包括Stl－Str基因間區(qū)域的DNA探針，研究者發(fā)現(xiàn)SaPIbov1 Stl結(jié)合在這個(gè)位點(diǎn)上，但是w11 Dut卻沒有。這表明由于Stl的競爭，Dut不能作用于調(diào)節(jié)結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)檫@個(gè)片段包含Stl的啟動因子，所以Dut也不能抑制Stl的表達(dá)。Dut封閉Stl劑量依賴性介導(dǎo)凝膠移位，提示脫阻遏作用涉及到Dut與Stl的結(jié)合。噬菌體誘導(dǎo)SaPI脫阻遏作用的機(jī)制涉及具有脫阻遏物功能的蛋白質(zhì)與Stl結(jié)合而防止它與DNA結(jié)合。如果Dut使Stl與它的靶位點(diǎn)結(jié)合斷開，將誘導(dǎo)Stl抑制的SaPI基因轉(zhuǎn)錄。SaPI誘導(dǎo)的Dut激活轉(zhuǎn)錄通過專門破壞Stl－DNA復(fù)合物而發(fā)揮作用[8]。

4 結(jié)論與展望

引起中毒性休克的SaPIs受普遍性阻遏因子Stl的控制被動地存在于宿主染色體中;來自輔助噬菌體的“兼職蛋白”作用于致病性島脫Stl阻遏，可誘導(dǎo)致病性島活化。及時(shí)深入地研究Stl阻遏因子控制引起中毒性休克的SaPIs，將為研制更敏感的檢測手段、有效的減毒疫苗、基因工程疫苗和治療藥物開辟了新的途徑。但是仍有難題需解決，如是否Str的啟動子控制去Stl阻遏的、有活性的SaPI基因主要從右側(cè)轉(zhuǎn)錄?SaPI被誘導(dǎo)涉及的區(qū)域是哪部分?是否存在其它因子介導(dǎo)的干擾Stl阻遏作用?等等。

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