葛根總黃酮對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷保護(hù)作用及其機(jī)制的初步研究

方士英，徐茂紅，趙克霞，張小勇，汪洋奎，顧宏霞，陳秀明，羅太敏

(皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院1.藥學(xué)系、2.附屬醫(yī)院，安徽 六安 237000)

病毒性肝炎(viral hepatitis)是常見病、多發(fā)病，通過(guò)一系列的免疫應(yīng)答可引起肝細(xì)胞損傷，其中以細(xì)胞免疫為主，特別是TNF-α大量釋放，可導(dǎo)致肝臟急性出血性壞死［1］。葛根是豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi.的干燥根，含多種黃酮類成分，具有解酒毒、降血脂等多種藥理活性［2］。本研究采用刀豆蛋白A誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型，探討葛根總黃酮(TPF)的保護(hù)作用，以期為葛根總黃酮在病毒性肝炎等免疫性肝損傷中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料昆明種小鼠，♂，體質(zhì)量20～26 g，SPF級(jí)，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXK(皖)2011-001;葛根總黃酮:霍山野生葛根提取，安徽大別山葛業(yè)有限公司提供(總黃酮含量≥80%);聯(lián)苯雙酯(bifendate，BF):浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠(批號(hào):090801);刀豆蛋白A(美國(guó)Sigma公司);考馬斯亮藍(lán)、MDA、SOD、ALT、AST 試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為 20110402、20110623、20110624、20110624、20110620;IFN-γ、TNF-α 試劑盒為eBioscience公司產(chǎn)品;UV1200紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;酶標(biāo)儀(DNA9602)，北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1分組60只小鼠按體重隨機(jī)分為正常組、陽(yáng)性藥組(BF，200 mg·kg－1)、模型組、TPF 高、中、低(200、100、50 mg·kg－1)劑量組(生藥量)，每組10只。

1.2.2造模按免疫性肝損傷造模方法［3］，模型組尾靜脈注射Con A生理鹽水液20 mg·kg－1，造成急性免疫性肝損傷模型。

1.2.3給藥BF組和TPF高、中、低劑量組按0.2 ml·(10 g)－1體重每日灌胃給藥1次，正常組和模型組每日灌胃等體積的生理鹽水溶液1次，連續(xù)灌胃10 d。末次灌胃后，除正常組尾靜脈注射生理鹽水外，其余各組均尾靜脈注射Con A生理鹽水液20 mg·kg－1。禁食8 h后，摘眼球取血離心，留取血清待檢。

1.2.4指標(biāo)測(cè)定末次給藥禁食8 h后摘除眼球取血，離心15 min(3 000 r·min－1)，分離血清，測(cè)定血清中 ALT、AST值。取10%肝勻漿用同樣時(shí)間離心得上清液，測(cè)定上清液中 MDA、SOD、IFN-γ、TNF-α 含量，其中 IFN-γ、TNF-α 采用ELISA法測(cè)定。各項(xiàng)檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒標(biāo)示方法操作。

1.3肝臟病理學(xué)觀察取相同部位肝組織，用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，做石蠟切片，每例均進(jìn)行蘇木精－伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織的病理變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.0軟件包處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以±s表示，組間顯著性用t檢驗(yàn)及相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1TPF對(duì)Con A致免疫性肝損傷小鼠血清中ALT、AST和 肝勻漿中MDA、SOD、IFN-γ、TNF-α的影響模型組小鼠與正常組比較差異有顯著性(P＜0.05);TPF高、中、低劑量組與模型組比較，其小鼠血清ALT、AST、肝勻漿中MDA、IFN-γ、TNF-α含量降低，差異有顯著性(P＜0.05);肝勻漿中SOD升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見Tab 1。

Tab 1 Influence of TPF on ALT，AST in serum and MDA，SOD，IFN-γ，TNF-α in liver homogenate of mice induced by Con A(±s，n=10)

#P＜0.05 vs model;*P＜0.05 vs control

Group Dose/mg·kg－1 Pro Control - 52.4 ±9.69 72.5 ±7.62 1.78 ±0.15 98.6 ALT/IU·L－1 AST/IU·L－1 MDA/μmol·g－1Pro SOD/kU· g－1Pro IFN-γ/μg·g－1Pro TNF-α/μg·g－1±10.1 0.31 ±0.07 0.43 ±0.11 Model - 171.0 ±27.0* 186.6 ±16.6* 6.53 ±0.21* 50.5 ±5.68* 0.78 ±0.31* 0.98 ±0.13*TPF 200 135.1 ±13.7# 77.6 ±23.1# 2.25 ±0.57# 70.5 ±7.34# 0.46 ±0.10# 0.52 ±0.18#100 153.0 ±11.6# 97.2 ±12.8# 2.35 ±0.87# 68.7 ±8.56# 0.60 ±0.26# 0.66 ±0.07#50 158.8 ±7.42# 113.7 ±6.60# 2.71 ±0.45# 64.3 ±7.82# 0.73 ±0.30# 0.72 ±0.05#BF 200 154.6 ±12.5# 96.5 ±15.1# 2.10 ±0.68# 67.4 ±8.72# 0.42 ±0.20# 0.64 ±0.15#

2.2TPF對(duì)Con A致免疫性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響光鏡下可見，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈周圍肝竇呈放射狀發(fā)散，匯管區(qū)未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肝細(xì)胞腫脹，點(diǎn)狀變性壞死，散在脂肪滴。聯(lián)苯雙酯組和TPF高、中劑量組肝細(xì)胞腫脹較模型組減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肝細(xì)胞損傷程度減輕。

3 討論

目前，小鼠免疫性肝損傷的模型主要有卡介苗加脂多糖誘導(dǎo)、丙酸桿菌或痤瘡丙酸桿菌加脂多糖誘導(dǎo)以及Con A誘導(dǎo)等［3］。Con A誘發(fā)的小鼠急性肝損傷是篩選治療急性肝炎和暴發(fā)性肝衰竭藥物的較理想的動(dòng)物模型［4］。本研究結(jié)果顯示，TPF各劑量組能降低小鼠血清中ALT、AST和升高肝勻漿中MDA水平，增強(qiáng)肝勻漿中重要的抗氧化酶SOD的活性，減輕肝臟的病理性損傷，表明TPF對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。

Con A活化Th細(xì)胞后刺激Th細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的IFN-γ、TNF-α 等細(xì)胞因子，其中 TNF-α 可激活核因子 κB誘導(dǎo)的TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及IFN－γ等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，在Con A誘導(dǎo)的肝損傷中起主要介導(dǎo)作用，急性肝損傷時(shí)，血清中TNF-α含量升高。高水平TNF-α是引起肝細(xì)胞壞死的一種重要細(xì)胞因子，既可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，也可以導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死［5］。IFN-γ可介導(dǎo) T細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的激活，促進(jìn)靜止的CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門h1細(xì)胞［6］，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的TNF-α和IFN-γ，加速肝細(xì)胞的壞死。TPF各劑量組能明顯降低小鼠肝勻漿中 IFN-γ、TNF-α水平，因此，其對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制可能與抗氧化和抑制細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α等表達(dá)有關(guān)。

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