常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝癌模型研究進(jìn)展

李曉娟，白云峰，崔 智，高 蓉，鮑龍濤，李瑞生

(1.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039；2.解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100853)

我國(guó)是肝癌(HCC)發(fā)病率較高的國(guó)家之一，近20年來(lái)肝癌的病死率呈上升趨勢(shì)，已成為我國(guó)第2位惡性腫瘤［1］，也是世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤之一。肝癌是由病毒、化學(xué)致癌物等多病因作用，因癌基因或癌相關(guān)基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新復(fù)活等諸多因素引起肝細(xì)胞生長(zhǎng)失控而致癌變，經(jīng)啟動(dòng)、促進(jìn)和演變等多階段的發(fā)病過(guò)程，并與基因調(diào)控和表達(dá)密切相關(guān)［2］，由此可見(jiàn)肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是多因素作用的結(jié)果，目前肝癌的致病機(jī)理尚未研究清楚，尚未尋找到有效的治療方法，因此深入闡明肝癌的致病機(jī)理對(duì)于研發(fā)新的藥物治療靶位和解決臨床治療難點(diǎn)具有十分重要的意義。大量的研究者應(yīng)用常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠、大鼠、裸鼠、倉(cāng)鼠、家兔、土撥鼠和豬等建立了許多優(yōu)質(zhì)的肝癌動(dòng)物模型，這些模型的建立采用的方法各不相同，常見(jiàn)的有自發(fā)性肝癌模型、誘發(fā)性肝癌模型、移植性肝癌模型和轉(zhuǎn)基因肝癌模型等。這些動(dòng)物模型從不同的角度揭示了肝癌的發(fā)病原因和致病機(jī)理，也為今后尋求有效診斷方法，提高人類肝癌的診治率提供了理論參考。下面就針對(duì)這些動(dòng)物模型的研究進(jìn)展情況進(jìn)行探討和綜述。

1 小鼠

應(yīng)用小鼠來(lái)復(fù)制動(dòng)物模型是最經(jīng)濟(jì)最理想的，目前小鼠肝癌動(dòng)物模型主要包括化學(xué)誘導(dǎo)性、移植性、轉(zhuǎn)基因和裸小鼠肝癌動(dòng)物模型。化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌模型的特點(diǎn)是其發(fā)生過(guò)程類似于人肝癌發(fā)生的“損傷-纖維化-惡性轉(zhuǎn)化”周期變化，誘導(dǎo)劑包括：二乙基亞硝胺(DEN)、過(guò)氧化物酶體激增劑、四氯化碳、黃曲霉素(AFB)和硫代乙酰胺等，常規(guī)的誘導(dǎo)方法通常是將其中一種或幾種組合作用于小鼠建模，新生小鼠對(duì)AFB極敏感，而成年小鼠有一定耐受性［3］，通常誘導(dǎo)建模周期為4～6個(gè)月甚至一年。劉勇等［4］使用 DEN、部分肝切除(PH)和二乙?；?2-AAF)復(fù)合法建立小鼠原發(fā)性短期誘導(dǎo)模型，不僅能夠節(jié)約大量的人力物力時(shí)間，而且實(shí)驗(yàn)效果很好。

移植性小鼠肝癌模型的優(yōu)點(diǎn)是飼養(yǎng)方便，操作簡(jiǎn)單，此模型適用于藥物篩選及較大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)性治療。目前常用的移植腫瘤包括H615肝癌(615系小鼠同基因型瘤株)和H22腫瘤株。H615肝癌模型是將H615肝癌瘤株植入615近交系小鼠腫瘤皮下、肌肉或腹腔內(nèi)，此模型對(duì)化療藥物的敏感性與肝癌的臨床化療效果相近，可用作肝癌的基礎(chǔ)研究及藥效學(xué)研究以及不同治療方案的比較與探索［5］。H22腫瘤株屬于小鼠的肝細(xì)胞瘤(保持了上皮來(lái)源腫瘤的基本特征)，是將OAAT涂于C3H小鼠的皮膚100次后誘發(fā)，皮下傳代的肝臟實(shí)體瘤。此模型可廣泛應(yīng)用于腫瘤基礎(chǔ)研究及藥物篩選，并且成為了公認(rèn)的中醫(yī)藥研究抗腫瘤作用及機(jī)制的良好腫瘤模型［6］。

而目前最新應(yīng)用的是轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型，由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可按照研究需要進(jìn)行設(shè)計(jì)和培育，其建立過(guò)程的本身就可進(jìn)行疾病機(jī)制的研究，同時(shí)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程是一個(gè)立體的實(shí)驗(yàn)體系，不但能從動(dòng)物整體的組織器官水平上進(jìn)行研究，還可以深入到細(xì)胞水平和分子水平，為肝癌發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和臨床醫(yī)學(xué)研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)體系。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多選用CD1、C57BL/6×DBA、C57BL/6×SJL等品系小鼠，單基因和雙基因均可作為轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)的外源性基因，單基因如 HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型［7］、SV40轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型［8］；雙基因如 TGFα與 c-myc雙轉(zhuǎn)入的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型［9］。轉(zhuǎn)入單基因建立的肝癌動(dòng)物模型比轉(zhuǎn)入雙基因建立的動(dòng)物模型成功率高，方法步驟簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)入雙基因建立的動(dòng)物模型所需時(shí)間明顯縮短，有利于實(shí)驗(yàn)研究。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立肝癌動(dòng)物模型為肝腫瘤的病因?qū)W研究開(kāi)辟了一條新的研究領(lǐng)域。但轉(zhuǎn)基因肝癌動(dòng)物模型也有制備的技術(shù)難度比較高，操作程序復(fù)雜，成本較高等不足之處。

裸小鼠肝癌動(dòng)物模型是將人肝癌細(xì)胞株或肝癌組織塊直接移植到裸小鼠體內(nèi)而建立的模型，屬于人鼠異種移植，也是最接近人的一種肝癌模型復(fù)制方法，移植部位根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)條件的不同可采用腹腔移植、皮下移植和肝內(nèi)移植。移植方法有組織塊移植法、懸液移植法、組織勻漿移植法等?，F(xiàn)已建立了5株裸小鼠人肝癌組織模型LTNM 1～5和1株裸小鼠人肝癌細(xì)胞株模型LCNM1，均保留了原發(fā)性人肝癌形態(tài)及功能(分泌人甲胎蛋白)的特征。但大部分人裸小鼠異種移植性肝癌模型轉(zhuǎn)移率較低，孫昉憲等［10］經(jīng)篩選建立的裸小鼠人肝癌高轉(zhuǎn)移模型LCI-D20是目前研究人肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)理及抗轉(zhuǎn)移治療較為理想的高轉(zhuǎn)移模型，被廣泛用于人肝癌的基礎(chǔ)治療研究。

2 大鼠

大鼠由于其體型大于小鼠，便于操作，是復(fù)制肝癌動(dòng)物模型最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。目前主要以移植性和誘發(fā)性大鼠肝癌動(dòng)物模型為主，而裸大鼠人肝癌模型仍在不斷探索研究中。

移植性大鼠肝癌模型具有動(dòng)物飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、移植方法簡(jiǎn)便、移植成功率高、腫瘤生長(zhǎng)快、患鼠生存期短、腫瘤生物學(xué)特性穩(wěn)定而均一(均為肝細(xì)胞癌及高濃度甲胎蛋白分泌)等優(yōu)點(diǎn)［11］。種鼠主要以BERH-2移植性大鼠和Walker-256鼠肝癌肉瘤帶瘤大鼠為主。BERH-2移植成功率較高，適于肝癌的局部治療研究。而 Walker-256瘤株來(lái)源于大鼠自發(fā)性乳腺癌，具有部分肉瘤性質(zhì)，能較好地模擬人肝癌的膨脹性和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)方式。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多選用雄性W istar大鼠，該模型性質(zhì)穩(wěn)定、制作方法簡(jiǎn)單，成功率高、周期短，自然生存時(shí)間為3～4周，已廣泛地應(yīng)用于肝癌影像學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)及肝癌局部治療。

根據(jù)移植部位的不同分為：腹腔移植、皮下移植和肝內(nèi)移植。①腹腔移植接種的肝癌主要生長(zhǎng)在肝與胃之間呈巨塊狀，有時(shí)在肝臟表面及腸系膜處和膀胱附近有一連串小珠狀的半透明腫瘤結(jié)節(jié)，晚期可出現(xiàn)癌性腹水。其優(yōu)點(diǎn)是移植成功率高，罕見(jiàn)自發(fā)消退，生存期短，缺點(diǎn)是腫瘤較深，位置不局限，形態(tài)不規(guī)則而不易觀察及測(cè)量。②皮下移植常因腫瘤淺在，局限，便于觀測(cè)而被采用。但最大的缺點(diǎn)是有較高的自發(fā)消退率。此種模型一般用于研究腫瘤自發(fā)消退機(jī)理。③肝內(nèi)移植接種的腫瘤位于肝臟內(nèi)部，呈圓形或橢圓形，膨脹性和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腹水發(fā)生率高。其優(yōu)點(diǎn)是腫瘤在肝臟中生長(zhǎng)，與臨床肝癌病例基本相似，且實(shí)驗(yàn)周期短，模型易于建立，是研究肝癌局部治療的良好模型［12］。

而誘發(fā)性大鼠肝癌模型是指用化學(xué)、物理或生物的致癌因素作用于動(dòng)物而形成的肝癌。其中化學(xué)藥物誘導(dǎo)法最常用，常用的化學(xué)藥物有二乙基亞硝胺(DEN)、黃曲霉素 B1(AFB1)、二甲基偶氮苯(DAB)、乙酰氨基芴(AAF)等，其中 DEN和 AFB1更為常用［13］，常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為 W istar、SD大鼠?；瘜W(xué)致癌物質(zhì)誘發(fā)的肝癌模型操作簡(jiǎn)單，是目前應(yīng)用較廣泛的一種方法。其特點(diǎn)是接近于人類肝癌的發(fā)病特點(diǎn)和過(guò)程、起病隱匿、病程長(zhǎng)，誘癌成功率較高，腫瘤多為彌漫結(jié)節(jié)型。但其誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，動(dòng)物死亡率相對(duì)較高，且肝癌出現(xiàn)的時(shí)間、部位、病灶數(shù)等存在個(gè)體差異。由于此類模型誘發(fā)因素和條件可人為控制，因此多用于肝癌病因?qū)W、發(fā)生學(xué)、發(fā)病機(jī)制、遺傳及生物學(xué)特性的研究。①二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型的特點(diǎn)是誘癌成功率高，主要以肝細(xì)胞癌為主。常用3-4月齡、體重小于250g的大鼠較容易誘發(fā)肝癌。Nakatani等［14］認(rèn)為雄性比雌性形成癌前增生性結(jié)節(jié)的數(shù)目多，摘除睪丸的大鼠可明顯減少肝癌的發(fā)生。②黃曲霉素B1(AFB1)誘發(fā)大鼠肝癌模型誘癌周期常需要一年以上，目前多選用較大劑量AFB1誘癌，Guyonnet等［15］建立了單劑量 AFB1致大鼠肝癌的短期實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，給藥途徑一般用AFB1添加在飼料中食用，也可以腹腔注射給藥，一般不用灌胃給藥。③二甲基氨基偶氮苯(DAB)誘發(fā)大鼠肝癌模型使用含有0.06% DAB的飼料喂大鼠，同時(shí)控制飼料中維生素 B2含量(不超過(guò)1.5～2mg/kg)，經(jīng)4～6個(gè)月可誘發(fā)成功［16］。④乙酰氨基芴(AAF)誘發(fā)大鼠肝癌模型主要給成年大鼠含0.03%2AAF標(biāo)準(zhǔn)飼料，按2～3mg/d/只標(biāo)準(zhǔn)給予 2AAF，經(jīng) 3～4個(gè)月可誘發(fā)成功［17］。

裸大鼠人肝癌模型同裸小鼠人肝癌模型相同，均為人鼠異種移植，也是最接近人的一種肝癌模型復(fù)制方法，但裸大鼠肝癌模型目前的文獻(xiàn)報(bào)道較少，沈艷等［18］建立了裸大鼠移植人肝癌模型并且與裸小鼠移植肝癌模型進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，與裸小鼠肝癌模型相比其產(chǎn)瘤量大，供血量多，動(dòng)物形體大，適于實(shí)施一些外科小手術(shù)，主要用于腫瘤生物學(xué)特性、陽(yáng)性掃描及多種實(shí)驗(yàn)性治療研究，是肝癌模型研究的新成果。

3 倉(cāng)鼠

倉(cāng)鼠(敘利亞金色倉(cāng)鼠)在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)以及免疫學(xué)等方面與人有相似之處，可用于制作人類多種疾病的整體動(dòng)物模型。因此在大鼠、小鼠、裸鼠的研究基礎(chǔ)上，研究開(kāi)發(fā)使用此種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立肝癌模型，為肝癌的治療研究又提供了一個(gè)新的研究平臺(tái)。2009年毛庭枝等［19］在白紀(jì)剛等［20］應(yīng)用倉(cāng)鼠pGHAM-1細(xì)胞株建立倉(cāng)鼠移植性胰腺癌模型的基礎(chǔ)上，又建立了倉(cāng)鼠移植性肝癌模型，將pGHAM-1培養(yǎng)后接種于倉(cāng)鼠皮下，成瘤后再接種于倉(cāng)鼠肝臟，結(jié)果證實(shí) pGHAM-1種植于肝臟的成瘤率達(dá)100%。此動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)具有原位成瘤率高、復(fù)制方法簡(jiǎn)便易行，是研究肝癌發(fā)病機(jī)理的又一良好動(dòng)物模型。

4 家兔

目前有關(guān)家兔肝癌動(dòng)物模型的文獻(xiàn)報(bào)道較少，主要以鼠類模型居多，但各種鼠類模型也存在著許多不足之處，如不適合于外科手術(shù)操作及介入治療方面的研究。家兔肝癌動(dòng)物模型目前研究報(bào)道較多的主要是兔VX2肝癌模型，兔VX2移植瘤來(lái)源于Shope乳頭狀病毒誘導(dǎo)的野兔皮膚鱗狀細(xì)胞癌，經(jīng)數(shù)次傳代后而建立，可被接種至肝、腎、肺等器官制成多種移植瘤動(dòng)物模型［21］。兔VX2肝癌模型制作按接種所使用的瘤株形態(tài)可分為瘤細(xì)胞懸液接種、瘤塊懸液接種、瘤組織小塊接種［22］。其中瘤組織小塊接種法成功率高，對(duì)瘤細(xì)胞消耗小，性質(zhì)穩(wěn)定。韓冰［23］等應(yīng)用改良組織塊接種法將組織塊插入注射針頭中，以細(xì)胞懸液注射法的方式注入肝內(nèi)。而移植方法以肝實(shí)質(zhì)接種為主，以往多使用開(kāi)腹手術(shù)進(jìn)行腫瘤移植，而現(xiàn)多借助在超聲、CT等影像監(jiān)視下經(jīng)皮穿刺進(jìn)行肝實(shí)質(zhì)接種，此種方法操作更簡(jiǎn)便，成瘤率更高，且未改變腫瘤的生長(zhǎng)特性，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)創(chuàng)傷小，動(dòng)物存活率高。這種模型的制作由于簡(jiǎn)便易行，實(shí)驗(yàn)周期短、成功率高、重復(fù)性好、模型性質(zhì)穩(wěn)定、同時(shí)具備高血供、易形成肺轉(zhuǎn)移而被廣泛地應(yīng)用于肝癌的診斷及治療方面的研究。但此模型不能很好的模擬人肝癌形成過(guò)程和臨床特點(diǎn)，其病理形態(tài)學(xué)也存在許多差異，因此該動(dòng)物模型的研究和應(yīng)用相對(duì)較少。

5 土撥鼠

土撥鼠是對(duì)乙型肝炎病毒比較敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，1978年summers等［24，25］發(fā)現(xiàn)土撥鼠具有很高的慢性肝炎發(fā)生率，其中23%在尸解時(shí)發(fā)現(xiàn)有肝細(xì)胞癌，并且分離到一種在基因體構(gòu)造或生物學(xué)特性上與人類乙型肝炎病毒有高度相似性的病原體土撥鼠肝炎病毒(WHV)。土撥鼠感染該病毒后的病程和人類感染乙型肝炎病毒比較相似，會(huì)引起慢性肝炎和肝癌，但不同的是不會(huì)出現(xiàn)肝硬化現(xiàn)象。攜帶WHV的土撥鼠在3年內(nèi)有近100%的幾率會(huì)演變呈肝細(xì)胞癌［26］，因此土撥鼠成為了研究人類乙型肝炎病毒復(fù)制、自然病史、致病機(jī)制及防治方法最好的動(dòng)物模型之一，也是研究肝癌成因及治療很重要的動(dòng)物模型［27］。但由于土撥鼠很容易感染乙型肝炎病毒，復(fù)制肝癌的時(shí)間需要2～3年，因此土撥鼠更多是應(yīng)用于乙型肝炎病毒的模型建立，而不適合于短期肝癌模型建立的研究。

6 豬

由于大動(dòng)物肝癌模型病變復(fù)雜，不容易重復(fù)，發(fā)病率低，而不常用于肝癌模型的復(fù)制。但是實(shí)驗(yàn)豬肝與人肝在解剖結(jié)構(gòu)上存在很多相似之處，研究人員采用2-乙酰氨基酸制備豬肝癌模型，小劑量多次給藥即可致癌變。因此，在肝癌病理結(jié)構(gòu)變化的研究過(guò)程中也有一定的應(yīng)用前景。目前介入治療、熱療等結(jié)合治療成為肝癌治療的重要手段，可以采用耐熱性好的實(shí)驗(yàn)豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)研究熱療治療的劑量，療程長(zhǎng)短以及介入與熱療聯(lián)合治療組合等問(wèn)題的探索［28］。

7 討論

復(fù)制理想的肝癌動(dòng)物模型應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①腫瘤的形成過(guò)程與人類肝癌的自然發(fā)生過(guò)程相似，腫瘤生長(zhǎng)在肝上，以單性為主；②肝癌細(xì)胞的病理形態(tài)與人的肝癌細(xì)胞相似；③血清AFP及腫瘤酶學(xué)檢測(cè)呈陽(yáng)性；④動(dòng)物模型穩(wěn)定、易于復(fù)制、操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)周期短［29］。大量的研究者采用了不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群和不同方法力求建立符合以上標(biāo)準(zhǔn)的肝癌動(dòng)物模型，雖然這些動(dòng)物模型具備了一定的優(yōu)越性，但也受到許多限制性因素的制約和其重復(fù)性差等不足之處。如人肝癌裸鼠模型是目前實(shí)驗(yàn)中最能反應(yīng)人類肝癌生物學(xué)特性的“活試管”，但裸小鼠飼養(yǎng)條件要求高，體形小，操作精細(xì)，無(wú)菌要求高，不適于作經(jīng)肝動(dòng)脈插管注射等藥物的靶向性研究。裸大鼠對(duì)異種腫瘤易于接受，但飼養(yǎng)較為困難，價(jià)格昂貴，至今不能廣泛地被推廣應(yīng)用。

隨著對(duì)肝癌治療和基礎(chǔ)研究的日益深入，通過(guò)基因打靶技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)、核酸干擾技術(shù)等可以將離體培養(yǎng)、基因敲除或基因定點(diǎn)修飾后的動(dòng)物體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成動(dòng)物個(gè)體，將很好地解決動(dòng)物轉(zhuǎn)基因效率低和基因表達(dá)方面的問(wèn)題，這些可能成為肝癌動(dòng)物模型研究新的發(fā)展方向。2003年Kataoka實(shí)驗(yàn)室采用基因打靶法成功建立了PLCε基因敲除小鼠，研究發(fā)現(xiàn) PLCε是癌基因產(chǎn)物Ras及抑癌基因產(chǎn)物Rap的新效應(yīng)蛋白［30］。Shuzo Ikuta等［31］進(jìn)一步證明了TPA介導(dǎo)PLCε的活化而誘發(fā)炎癥，導(dǎo)致腫瘤的形成。本課題組擬采用化學(xué)誘癌法在PLCε-/-小鼠體內(nèi)建立肝癌動(dòng)物模型，對(duì)比PLCε-/-小鼠與 PLCε+/+小鼠肝臟的病理學(xué)改變、肝腫瘤及癌旁組織形態(tài)、腫瘤及癌旁細(xì)胞增殖情況及分子標(biāo)記物的改變，分析 ras基因構(gòu)造以及突變情況，以及PLCε在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的致病機(jī)理。因此，利用基因打靶技術(shù)可以建立更加符合人體肝癌多種生物學(xué)特性的動(dòng)物模型，培育出符合實(shí)驗(yàn)要求、與人類近緣、使其誘癌過(guò)程相似于人肝癌的發(fā)生過(guò)程，且誘癌率高，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，便于進(jìn)行藥物干預(yù)和療效分析的新的動(dòng)物模型，從而建立一種理想的基因敲除小鼠肝癌動(dòng)物模型來(lái)詮釋人類肝癌的發(fā)病原因和致病機(jī)理。

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