家蠅幾丁質(zhì)酶基因的序列分析、克隆和誘導(dǎo)表達(dá)＊

國 果，吳建偉，吳沁怡，付 萍，張 勇

幾丁質(zhì)是構(gòu)成大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分，同時(shí)也廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物外殼和軟體動(dòng)物中。它不僅是昆蟲的重要結(jié)構(gòu)組織，也是昆蟲防止機(jī)械損傷和生物危害的屏障。幾丁質(zhì)酶（chitinase）是幾丁質(zhì)降解酶系重要成員，屬于糖苷水解酶18家族GH18，能夠?qū)锥≠|(zhì)聚合物分解成殼糖乙糖苷和乙酰葡糖胺糖苷兩個(gè)部分［1］。該酶廣泛存在于各種真菌、植物、昆蟲和魚類等生物中。催化水解昆蟲幾丁質(zhì)的酶主要是幾丁質(zhì)酶，通過阻斷幾丁質(zhì)酶，可以阻止昆蟲蛻皮和圍食膜再生，以達(dá)到殺滅昆蟲的目的［2－3］。因此，研究獲取昆蟲來源的幾丁質(zhì)酶可以作為生物殺蟲劑來控制昆蟲和真菌病害。目前已克隆得到黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、岡比亞按蚊 （Anopheles gambiae）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、家蠶（Bombyx mori）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）等二十幾種昆蟲的幾丁質(zhì)酶基因cDNA［4－6］。

家蠅（Musca domestica）是世界性分布的衛(wèi)生昆蟲，從幼蟲到成蟲均生活在骯臟的環(huán)境中，是許多病原體的攜帶者，約60多種引起人類和動(dòng)物疾病的病原體與家蠅有關(guān)，包括傷寒、霍亂、痢疾、肺結(jié)核及一些寄生蟲病等。目前對(duì)家蠅的研究主要是集中在抗菌肽方面［7］，對(duì)其幾丁質(zhì)酶的研究尚未見報(bào)道。本研究克隆了家蠅幾丁質(zhì)酶基因，并建立了體外表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，為進(jìn)一步研究家蠅幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)特性和有效利用奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 文庫、菌種及質(zhì)粒 家蠅三齡幼蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建和EST測序及UniGene分析由北京華大合作完成。原核表達(dá)質(zhì)粒pET 28a（＋）和大腸桿菌BL21（DE3）由中山大學(xué)引進(jìn)本實(shí)驗(yàn)室保存。

1．1．2 主要試劑及工具酶 Ex Taq酶（含dNTP），EcolⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶，DNA 標(biāo)準(zhǔn)（DL15，000，DL2，000）均購自大連寶生物工程公司；異丙硫代β－D半乳糖苷（IPTG）購自美國Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒購自廣州鉑爾生物。

1．1．3 引物合成和DNA測序 基因擴(kuò)增引物合成和重組質(zhì)粒DNA測序由Invitrogen上海生物技術(shù)有限公司完成。

1．2 方法

1．2．1 家蠅幾丁質(zhì)酶基因Ⅰ（MDCⅠ）的識(shí)別及序列測定 對(duì)測定得到的家蠅三齡幼蟲EST序列進(jìn)行BLASTX分析，從中篩選獲得編碼家蠅幾丁質(zhì)酶基因的文庫質(zhì)粒（編號(hào)為005－C09），命名為MDCⅠ。

1．1．2 MDCⅠ 基因的生物信息學(xué)分析 利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System，ExPASy）提供的生物信息學(xué)工具，分析預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、修飾位點(diǎn)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)及二級(jí)結(jié)構(gòu)等。

1．2．3 MDCⅠ 基因的擴(kuò)增 根據(jù)已獲得的MDCⅠ編碼序列，利用DNA Club和Primer5．0設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′GCCGAATTCTTTCTAGTGGTATGGCAGCAG 3′帶EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物：5′GCGAAGCTTTCTGTTGGAATGATCAGT GG 3′，帶HindⅢ酶切位點(diǎn)。

以家蠅三齡幼蟲cDNA文庫中MDCⅠ基因的質(zhì)粒為模板，94℃預(yù)變性5min后，熱循環(huán)參數(shù)為94℃1min，59℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳回收。

1．2．4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒（pET 28a（＋）－MDCⅠ）的構(gòu)建及鑒定 將PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒pET 28a（＋）經(jīng)EcoRⅠ、HindⅢ 雙酶切后回收，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21／DE3感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽性克隆，對(duì)陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR，雙酶切和測序鑒定。

1．2．5 MDCⅠ基因在大腸桿菌BL 21／DE3中的誘導(dǎo)表達(dá) 取50μL培養(yǎng)過夜的陽性克隆菌液，加入含有卡那霉素的5mL LB培養(yǎng)基中（菌液／培養(yǎng)基為1／100），37℃220r／min振搖至 OD600＝0．4～0．6時(shí)，加入IPTG至終濃度1mmol／L，誘導(dǎo)表達(dá)5h。離心收集菌體，在沉淀中加入100μL 1×SDS－PAGE上樣緩沖液，煮沸5min，13000r／min離心1min取上清10μL進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析。

2 結(jié) 果

2．1 序列分析 MDCⅠ基因與果蠅的同源基因氨基酸序列的一致性可達(dá)60%～70%，ORF全長753bp，編碼251個(gè)氨基酸（圖1），預(yù)測分子量為28．63kDa，理論等電點(diǎn)（pI值）5．78。含有3個(gè)半胱氨酸，在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。

MotifScan（模序）分析顯示，該蛋白含有1個(gè)N－糖基化位點(diǎn)，3個(gè)N－肉豆蔻?；稽c(diǎn)，6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)及1個(gè)幾丁質(zhì)酶的活性位點(diǎn)；由Signal P 3．0預(yù)測N端含有23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽；PredictProtein分析蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，MDCⅠ蛋白有一個(gè)跨膜區(qū)位于aa6－aa16，Sec預(yù)測α螺旋（H）、β折疊（E）和無規(guī)則卷曲（L）的比例是：29．54：17．79：52．67，以無規(guī)則卷曲為主。

BLAST對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，MDCⅠ中含有幾丁質(zhì)酶的保守結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)，屬于糖苷水解酶18家族（圖2）。

圖1 家蠅幾丁質(zhì)酶基因Ⅰ開放閱讀框cDNA序列及對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸序列Fig．1 Full－length cDNA sequence of MDCⅠand the amino acid sequence encoded by the ORF

2．2 MDCⅠ基因擴(kuò)增及原核重組質(zhì)粒的鑒定MDCⅠ基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，獲得了800bp左右的特異條帶（圖3泳道1）。將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果顯示（圖3泳道3）：重組質(zhì)粒雙酶切后，在800bp左右有一清晰的條帶，與目的基因的大小基本相符，提示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將挑選的陽性克隆子送Invitrogen公司，進(jìn)一步以pET 28a（＋）的通用引物對(duì)重組質(zhì)粒測序，結(jié)果表明相應(yīng)的插入序列與目的基因cDNA序列一致，證明MDCⅠ基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2．3 目的基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE鑒定 取重組菌誘導(dǎo)前后的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的重組菌約在32kDa左右出現(xiàn)表達(dá)條帶，與目的蛋白預(yù)測的分子量（28．63kDa）加上所帶His標(biāo)簽分子量（約3kDa）基本相符，而未誘導(dǎo)菌無此條帶（圖4）。

圖2 GenBank中MDCⅠ功能域分析Fig．2 Functional domain analysis of MDCⅠin GenBank

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖Fig．3 Identification of pET 28a（＋）－MDCⅠby PCR amplification and restriction enzymes digestionM：DNA Marker DL 2000；1：PCR product of MDCⅠamplified from cDNA library of Musca domestica；2：pET 28a（＋）digested by restriction enzymes EcoRⅠand HindⅢ；3：pET 28a（＋）－MDCⅠdigested by restriction enzymes EcoRⅠand HindⅢ

3 討 論

圖4 重組質(zhì)粒pET 28a（＋）－MDCⅠ在大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE電泳分析1：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、3：IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；4、5：未誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物箭頭所指為目標(biāo)蛋白Fig．4 SDS－PAGE analysis on prokaryotic expression product of pET 28a（＋）－MDCⅠM，1：Protein marker；2，3：BL21cell containing IPTG induced pET 28a（＋） －MDCⅠ；4，5：BL21 cell containing uninduced pET 28a（＋）－MDCⅠ

一種昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)酶基因有1個(gè)還是多個(gè)在很長時(shí)間內(nèi)存在爭議，隨著昆蟲基因組測序的完成，Zhu Q等2004年首次報(bào)道在果蠅中有多個(gè)幾丁質(zhì)酶基因［8］。我課題組在對(duì)家蠅EST序列分析的過程中，也發(fā)現(xiàn)了家蠅體內(nèi)至少存在兩個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，本研究選取了其中一個(gè)基因進(jìn)行序列分析及克隆表達(dá)（另一個(gè)基因另文報(bào)道），命名為 MDCⅠ。MDCⅠ基因序列包含完整的開放閱讀框，為全長cDNA序列。序列分析顯示，該酶具有典型的幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)特征，從N端到C端依次含有信號(hào)肽、幾丁質(zhì)酶活性中心，編碼的氨基酸序列與18家族昆蟲幾丁質(zhì)酶有較高的相似性。一般認(rèn)為，昆蟲幾丁質(zhì)酶分子量在40～85kDa之間，比植物幾丁質(zhì)酶（25～40kDa）和細(xì)菌幾丁質(zhì)酶（20～60kDa）大［9］，而我們得到的MDCⅠ預(yù)測的蛋白分子量為28kDa左右，表達(dá)出的蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳也證實(shí)了其分子量與預(yù)測的分子量基本相符，提示家蠅幾丁質(zhì)酶分子量較其他昆蟲的小。

本研究將家蠅幾丁質(zhì)酶基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET 28a（＋）中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET 28a（＋）／MDCⅠ，所獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切、PCR和測序鑒定，證實(shí)含有目的基因片段，且連接、構(gòu)建正確。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL 21／DE3，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，電泳顯示重組蛋白條帶非常清晰，表明重組蛋白得到了高效表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究MDCⅠ的生物學(xué)活性及表達(dá)模式奠定了基礎(chǔ)。

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